石墨烯-殼聚糖修飾電極構(gòu)建石杉堿甲免疫傳感器

陳媛媛,高 璇,劉媛媛,尤金坤，張紅艷,余宇燕

(福建中醫(yī)藥大學 藥學院, 福建 福州 350122)

石杉堿甲(Huperzine A, HupA)是我國科學家劉嘉森于1986年從草藥千層塔(蛇足石杉)中分離得到的一種新型石松類生物堿有效單體[1]。作為一種天然、高效、可逆的乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑，近年來從蛇足石杉中提取的石杉堿甲被廣泛用于治療輕、中度老年性癡呆(又名阿爾茲海默癥)。雖然石杉堿甲是一種有潛力的治療老年癡呆的藥物，但其在植物中含量較低，存在形式多樣，還伴有成分復雜、結(jié)構(gòu)類似的共生生物堿，可供利用的野生資源極其有限，利用常規(guī)方法獲得大量天然的石杉堿甲相當困難[2]。除蛇足石杉外，還有多種植物如金線蓮[3]、伏貼石杉、皺邊石杉、四川石杉、金絲條馬尾杉、小接筋草等也含有石杉堿甲成分[4]，這促使人們開始研究從其他植物中提取石杉堿甲。因此，建立快速、靈敏度高、特異性強的石杉堿甲檢測方法，可為獲取石杉堿甲提供新方向，且對石杉堿甲相關(guān)藥物的質(zhì)量控制和檢測水平提高具有重要作用。

目前，測定石杉堿甲的常用方法有薄層掃描法[5]、高效液相色譜法[1]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、酶聯(lián)免疫試劑盒[7]等。電化學分析法是基于物質(zhì)在溶液中的電化學性質(zhì)的一類儀器分析方法，與常用檢測方法相比，該法操作更簡便、成本較低、靈敏度高，近年來被廣泛應用[8]。HupA具有抗氧化作用，利用該特點可研究其與[Fe(CN)6]3-/4-氧化還原體系的相互作用以建立檢測HupA的電化學方法。本實驗室前期建立了應用裸玻碳電極檢測石杉堿甲的電化學方法[9]，但該方法的檢測靈敏度與特異性存在局限性。

電化學免疫傳感器分析法具有電化學分析的高靈敏性以及免疫分析的高特異性，近年來發(fā)展迅速[10]。殼聚糖(CS)具有優(yōu)異的成膜能力和良好的附著力，但絕緣性導致其在電化學傳感器開發(fā)中的應用受限[11-12]。隨著納米材料與納米技術(shù)的飛速發(fā)展, 納米材料的引入成為制備高性能電化學生物傳感器的有效途徑。Au、Ag、Pt等貴金屬[13-15]以及碳納米管[16]等納米材料均已成功用于固定生物酶。還原態(tài)氧化石墨烯(rGO)是一類新型的二維蜂窩狀碳納米材料，具有較高的比表面積和很多含氧基團，可提供較多的活性位點，且其電子傳導能力和生物相容性好，作為碳材料在傳感器構(gòu)建領(lǐng)域具有很好的應用潛力[17]。將石墨烯/殼聚糖制成復合物可達到促進電極表面的電子轉(zhuǎn)移，有效固定抗體以及其他分子的目的[18-20]。本研究通過采用石墨烯-殼聚糖復合物修飾玻碳電極，將HupA抗體固定于電極上構(gòu)建石杉堿甲免疫傳感器，建立了一種操作簡單、靈敏度高、特異性強的檢測石杉堿甲的新方法。該方法為獲取HupA提供了新方向，對HupA相關(guān)藥物質(zhì)量的控制和檢測水平提高具有一定的積極意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高分辨率透射電子顯微鏡(日本日立公司)。FiveEasy Plus型精密pH計、ME204E電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ116型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。Ingsen-1030電化學分析儀(廣州盈思傳感儀器有限公司)，辰華660D 電化學工作站(上海辰華儀器有限公司 )，所有電化學實驗均通過三電極系統(tǒng)完成：Ag/AgCl 為參比電極，鉑電極為對電極，修飾的玻碳電極為工作電極。

1 mg/mL石墨烯分散液(rGO，南京先豐納米有限公司)；石杉堿甲單抗(anti-HupA實驗室自制)；KCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]·3H2O(西隴化工股份有限公司)；石杉堿甲對照品(>99%，上海源葉生物科技有限公司)；殼聚糖(CS)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(國藥集團化學試劑有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；牛血清白蛋白(BSA，北京索萊寶科技有限公司)；Tween-20(北京博奧拓達科技有限公司)；金線蓮干燥全草購自福建省同春藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地廣西，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學范世明教授鑒定。

1.2 實驗方法

1.2.1rGO-CS復合物的制備準確稱取0.002 g殼聚糖加入到10 mL 1%乙酸中，持續(xù)攪拌至無氣泡后得到透明殼聚糖溶液，于4 ℃儲存。準確量取5 mL rGO水溶液(1 g/L)于5 mL離心管中離心，除去上清液，加入DMF定容至5 mL,超聲溶解30 min，得到分散均勻的石墨烯懸濁液。取4 mL該懸濁液加至2 mL殼聚糖乙酸溶液中，超聲分散20 min，得到石墨烯-殼聚糖懸濁液(rGO-CS)，于4 ℃保存待用。

1.2.2電化學免疫傳感器的制備依次用0.3、0.05 μm 的氧化鋁粉末將玻碳電極拋光成鏡面，并先后于無水乙醇和水中各超聲5 min，將電極在室溫下晾干。于GCE表面修飾10 μL的rGO-CS溶液并使其在室溫下自然風干后，將修飾好的電極置于400 mmol/L EDC 和100 mmol/L NHS 混合溶液中活化40 min，取出后將15 μL anti-HupA 溶液修飾于電極上，置于37 ℃孵育2 h，最后將電極于37 ℃下在含3%BSA的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)中浸泡50 min，以封閉活性基團，得到rCO-GS 復合材料修飾的電化學免疫傳感器，用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST，pH 7.4)沖洗3次，于4 ℃保存待用。電化學免疫傳感器制備如圖1所示。

圖1 電化學免疫傳感器制備圖Fig.1 Preparation of HupA electrochemical immunosensor

1.2.3不同修飾電極的電化學表征采用CV法以及EIS法研究電極修飾過程中不同修飾電極的電化學行為。CV法的電位為-0.2～0.6 V，掃速為50 mV/s；EIS的檢測頻率為0.1～105Hz。

1.2.4電化學免疫傳感器對HupA的電流響應測試將自制的石杉堿甲電化學免疫傳感器在不同濃度的HupA標準溶液中于37 ℃下孵育15 min，然后置于測試底液中，在室溫下進行DPV測量，脈沖范圍為-0.2～0.6 V，脈沖周期400 mV/s，間隔時間為50 ms，記錄峰電流變化值ΔIp，對不同濃度HupA標準品作標準曲線，并用DPV法檢測樣品中的石杉堿甲濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 rGO-CS復合物的透射電鏡(TEM)表征

圖2為rGO和 rGO-CS復合物的TEM表征圖，還原氧化態(tài)石墨烯呈現(xiàn)均勻的片狀結(jié)構(gòu)(圖2A)，殼聚糖具有良好的成膜性，且還原氧化態(tài)石墨烯在殼聚糖溶液中均勻分散(圖2B)，該表征結(jié)果與文獻[11]一致。

圖2 rGO(A)及rGO-CS復合物(B)的TEM圖Fig.2 TEM images of rGO(A)and rGO-CS complex(B)

2.2 不同修飾電極的電化學表征

圖3 不同修飾電極交流阻抗圖Fig.3 AC impedance diagrams of different modified electrodes

交流阻抗法(EIS)是研究修飾電極表面特性的有效方法，通過EIS法研究了電極修飾過程中不同修飾電極在0.1 mol/L KCl+10 mmol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]+0.1 mol/L PBS(pH 7.0)測試底液中的電化學行為。圖3顯示了不同修飾過程中電極的奈奎斯特曲線。由圖可知：裸玻碳GCE表面修飾CS后，可得到顯著增強的阻抗圖譜，這表明CS已被成功固定在電極表面，并阻礙了電子的轉(zhuǎn)移。當rGO-CS修飾到GCE上，rGO-CS/GCE的交流阻抗圖幾乎為一條直線，表明電極材料優(yōu)異的導電性使電子在電極表面與測試底液之間的轉(zhuǎn)移非常容易。當將anti-HupA修飾到rGO-CS/GCE電極后，譜圖中半圓的直徑增大，這是由于生物大分子抗體具有絕緣性質(zhì)。其后將修飾好的電極在BSA中封閉，得到的阻抗較大，這是由于BSA封閉了電極上剩余的活性位點所致。上述研究結(jié)果表明構(gòu)建的生物傳感界面可成功將anti-HupA固定。

圖4 不同修飾電極的循環(huán)伏安曲線Fig.4 Cyclic voltammograms of different modified electrodesa.rGO-CS/GCE, b.anti-HupA/rGO-CS/GCE, c.BSA/anti-HupA/rGO-CS/GCE, d.bare GCE, e.CS/GCE

CV曲線用于表征修飾電極過程中電子的傳遞速率，圖4為不同修飾電極在0.1 mol/L KCl+10 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L PBS(pH 7.0)測試底液中的循環(huán)伏安曲線。裸玻碳電極CV圖(曲線d)有1對可逆的氧化還原峰，當在裸電極上修飾殼聚糖后(曲線e)，響應電流明顯下降，這是由于殼聚糖對電極表面的電子轉(zhuǎn)移有明顯的阻礙作用；經(jīng)石墨烯-殼聚糖復合膜修飾之后電極電流明顯增大(曲線a)，表明石墨烯能提高修飾電極的電化學性能，石墨烯-殼聚糖復合膜有利于電化學方法檢測靈敏度的提高。當rGO-CS/GCE電極修飾上anti-HupA后，氧化還原電流減小(曲線b)，表明anti-HupA已被成功固定在電極表面；修飾好的電極用BSA封閉50 min后，其峰電流進一步減小(曲線c)，說明BSA已成功修飾在電極表面，封閉了電極上修飾抗體后剩余的活性位點。研究結(jié)果表明，rGO-CS納米復合物對于HupA的電化學傳感和傳感界面的成功構(gòu)建具有重要作用。

2.3 實驗條件優(yōu)化

2.3.1不同掃速的影響考察了掃速對氧化還原峰電流的影響，在10 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS(pH 7.0)測試底液中，將工作電極以不同掃速在-0.2～0.6 V電位范圍內(nèi)進行CV掃描。結(jié)果顯示，在10～1 000 mV/s掃速范圍內(nèi)，隨著掃速的增加，氧化峰電流明顯增大，還原峰電流明顯減小。在100～900 mV/s范圍內(nèi)，峰電流與掃速呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為Ip=0.787 5x+213.88(r=0.992 0)；Ip=-0.626 4x-199.94(r=0.991 8)，說明電極表面主要是受吸附控制的電極過程。

2.3.2抗體修飾量的選擇分別用4、6、8、10、15、20 μL anti-HupA(100 mg/L)修飾電極，于相同條件下孵育后，采用DPV法于10 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS(pH 7.0)測試底液中檢測修飾電極的電流響應。結(jié)果表明，隨著抗體修飾量的增加，固定到免疫傳感器上的anti-HupA增多，造成峰電流減小?？贵w量大于15 μL時，峰電流變化趨于平緩，說明此時抗體固定量已飽和，繼續(xù)增加用量將會出現(xiàn)抗體量過剩，因此實驗選擇15 μL作為抗體最佳修飾量。

2.3.3測試底液濃度的選擇測試底液濃度對免疫傳感器的電化學響應靈敏度有重要影響。在K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS(pH 7.0)測試底液中，分別考察了不同濃度(1、5、10、15、20、25 mmol/L)K3[Fe(CN)6]對免疫傳感器電化學響應值的影響。將制備的免疫傳感器置于HupA待測液中孵育后，分別在上述不同濃度的測試底液中進行DPV掃描，結(jié)果顯示在15 mmol/L K3[Fe(CN)6]測試底液中，免疫傳感器免疫反應前后的電流變化量最大，此濃度下免疫傳感器的靈敏度最高，因此實驗選擇濃度為15 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS(pH 7.0)的測試底液。

2.3.4測試底液pH值的選擇考察了測試底液pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0時對免疫傳感器電化學響應值的影響。將制備的免疫傳感器置于HupA待測液中孵育后，分別在上述不同pH值的測試底液中進行DPV掃描。結(jié)果顯示，在pH 6.5的測試底液中，免疫傳感器免疫反應前后電流變化量最大。因此，實驗選擇15 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS(pH 6.5)的測試底液。

2.3.5孵育時間的選擇抗原抗體反應需要一定的時間，因此孵育時間對免疫反應非常重要。將石杉堿甲免疫傳感器放入1.0×10-6mol/L HupA溶液中反應不同時間，利用DPV法考察了孵育時間(2～25 min)對免疫反應的影響。結(jié)果顯示，在2～15 min范圍內(nèi)DPV響應電流差值隨孵育時間的延長而增大，說明免疫反應隨著時間的延長不斷進行。當反應時間達到15 min后，電流變化趨于平緩，說明抗原抗體在15 min后已基本反應完全。因此實驗選擇15 min作為最佳孵育時間。

2.3.6孵育溫度的選擇通常升高抗原的孵育溫度有利于抗原與抗體反應的進行，但也可能導致抗體失活，故選擇適宜的孵育溫度十分重要。將制備的電化學免疫傳感器分別置于1.0×10-6mol/L HupA溶液中于25～50 ℃范圍內(nèi)孵育，利用DPV法研究孵育溫度對電流響應的影響。結(jié)果顯示，在25～37 ℃范圍內(nèi)，ΔI隨溫度升高不斷增大，這是因為抗原抗體的反應程度隨溫度升高而增強，隨著抗原-抗體復合物不斷增多，電極表面的電子傳遞阻力加大，使得響應電流變化值增大。在37 ℃時ΔI達到最大值，當溫度高于37 ℃時，電流變化量反而減小，原因是較高的溫度會導致抗體失活，使得產(chǎn)生的抗體-抗原復合物減少，電極表面的電子傳遞阻力減小。因此實驗選擇37 ℃為最佳孵育溫度。

2.4 標準曲線及檢出限

圖5 不同濃度HupA的差示脈沖伏安曲線Fig.5 DPV curves of electrochemical immunosensor to HupA HupA concentration(a-f)：1.0×10-10, 3.0×10-11, 3.0×10-12, 3.0×10-13, 1.0×10-13 , 0 mol/L;insert:ΔI vs lgc

本文選擇DPV法對HupA進行定量測定。配制不同濃度的HupA標準溶液，在優(yōu)化條件下，利用DPV法研究免疫傳感器的峰電流變化值與HupA濃度的關(guān)系(圖5)。由圖可知，當溶液中HupA濃度逐漸增大時，抗體與HupA的結(jié)合量隨之增加，而抗原-抗體復合物的增加使得電極表面的導電能力下降，因此DPV峰電流的降低值ΔI逐漸增大。ΔI值與HupA濃度(c)的對數(shù)在1.0×10-13～1.0×10-10mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔI= 20.629 lgc+ 283.98，r=1.000 0，檢出限(S/N=3)為3.0×10-14mol/L。如表1所示，與其他分析方法[1,6-7,9]相比，本文制備的免疫傳感器有較高的檢測靈敏度。

2.5 免疫傳感器的選擇性與特異性

表1 與其它分析方法的對比Table 1 Comparison between this method and other analysis methods

在優(yōu)化條件下，將制備的電化學免疫傳感器置于1.0×10-10mol/L的HupA標準溶液中孵育后，測定DPV響應值。在HupA標準溶液中分別加入10倍量的消旋山莨菪堿、丁溴東莨菪堿、阿托品孵育后，利用DPV分別測定，記錄電流值。電化學免疫傳感器在HupA標準溶液以及分別與3種干擾物共存時的Ip值分別為183.745、179.896、171.01、168.684 μA。數(shù)據(jù)表明，在加入干擾物的條件下電流變化值較小，說明該免疫傳感器具有良好的選擇性。

將制備的電化學免疫傳感器分別置于HupA和100倍量的消旋山莨菪堿、丁溴東莨菪堿、阿托品中孵育后，記錄電流變化值ΔI分別為78.021、3.064、3.945、8.541 μA?？梢?，該傳感器在分別檢測100倍量消旋山莨菪堿、丁溴東莨菪堿、阿托品時電流變化值較小，檢測石杉堿甲時變化值明顯，說明該免疫傳感器對HupA具有較強的特異性。

2.6 免疫傳感器的重復性與穩(wěn)定性

將制備的免疫傳感器于HupA標準溶液中孵育后，利用DPV法重復測定10次，峰電流變化為3.9%。將該免疫傳感器置于4 ℃密閉保存，每隔2 d于相同條件下用DPV法進行檢測，1周后電流值為初始值的90.6%，說明電極經(jīng)rGO/CS復合物修飾后具有良好的生物相容性，可以較長時間保持抗體的活性，從而使石杉堿甲免疫傳感器具有較好的重復性與穩(wěn)定性。

2.7 實際樣品的測定與加標回收率

將中藥材金線蓮粉碎，稱取0.6 g干粉于50 mL具塞三角瓶中，加入25 mL 70%的甲醇水溶液，超聲提取30 min，過濾，棄初濾液，收集續(xù)濾液作為供試品。在優(yōu)化條件下，采用DPV法測得金線蓮提取液中的HupA含量為8.883×10-12mol/L。取適量金線蓮提取液3份，分別加入7.5×10-12、9.0×10-12、1.0×10-11mol/L的HupA標準溶液進行加標回收率實驗，平行測定3次，得回收率為99.4%～102%，回收率良好。

3 結(jié) 論

基于還原態(tài)氧化石墨烯rGO的大比表面積和良好導電性，以及rGO/CS復合材料良好的生物相容性，本研究通過將石杉堿甲抗體固定到 rGO/CS 復合膜修飾的玻碳電極表面，制備了高靈敏度的石杉堿甲電化學免疫傳感器，通過檢測石杉堿甲抗原抗體特異性反應阻斷[Fe(CN)6]3-/4-氧化還原反應體系電子轉(zhuǎn)移的電流值變化，建立了檢測石杉堿甲的電化學免疫傳感器方法。將該法用于實際樣品中HupA含量的檢測，結(jié)果良好。與其他分析方法相比，該免疫傳感器具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強且成本低的特點，為HupA的獲取提供了新方向，也為HupA相關(guān)藥物質(zhì)量的控制和檢測提供了新的平臺，對藥物質(zhì)量控制的提高具有一定的積極意義。