高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定果汁飲品中砷、硒與鉻元素的無(wú)機(jī)形態(tài)

呂亞寧，宋 偉，沈貴蘭，金玉娟

(1.合肥海關(guān)技術(shù)中心，安徽 合肥 230022；2.食品安全分析與檢測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230022)

同種元素的不同形態(tài)在植物體內(nèi)的遷移蓄積規(guī)律不同，對(duì)人體的危害和在體內(nèi)的代謝方式也有較大差異，因此重金屬元素總量往往很難表征其生物活性和危害。元素的不同化學(xué)形態(tài)所表現(xiàn)的生物活性、遷移性和毒理影響等有很大差異，例如六價(jià)鉻比三價(jià)鉻毒性強(qiáng)，砷、硒等元素的無(wú)機(jī)形態(tài)對(duì)人體有害，而其有機(jī)形態(tài)一般具有一定的功能作用[1-4]。果汁生產(chǎn)在原料種植、加工和儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中易受到多種途徑的重金屬污染，如灌溉用水被污染后造成重金屬在果實(shí)中富集，加工設(shè)備及包裝材料中的重金屬溶出等，其中砷、鉻等是較常見(jiàn)的易污染重金屬元素，有必要對(duì)其危害性進(jìn)行分析。另外市場(chǎng)上出現(xiàn)的大量富硒果汁中硒的形態(tài)也直接影響產(chǎn)品的安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此在果汁的食用安全評(píng)價(jià)中，對(duì)元素形態(tài)的分析比總量測(cè)定更有意義，但樣品基體復(fù)雜、形態(tài)化合物不穩(wěn)定且含量較低，使得元素形態(tài)的分析比總量測(cè)定困難得多。

目前對(duì)食品中的元素形態(tài)研究多集中于單一元素不同形態(tài)的分析[5-11]，對(duì)多元素形態(tài)同時(shí)分析的報(bào)道較少。多元素形態(tài)同時(shí)分析測(cè)定能夠顯著提高分析效率，節(jié)約檢驗(yàn)成本。但不同元素的形態(tài)同時(shí)分析難度大，主要是由于：同種元素的不同形態(tài)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，其色譜表現(xiàn)相近，色譜分離有難度；不同元素的形態(tài)化合物的極性、pK值、離子化程度等有很大差異，增加了色譜分離模式選擇的難度。本文利用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)分析測(cè)定了As、Se、Cr 3種元素的無(wú)機(jī)形態(tài)，利用離子對(duì)試劑流動(dòng)相在C8色譜柱上分離，采用動(dòng)態(tài)反應(yīng)池技術(shù)實(shí)現(xiàn)了Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的同時(shí)分析，方法的分離度好，檢出限低，前處理簡(jiǎn)單，適用于果汁飲料中As、Se、Cr的無(wú)機(jī)形態(tài)分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Dlexar，ELAN DRC-e，美國(guó) PerkinElmer公司)；Milli-Q Element 純水機(jī)(美國(guó)Millipore 公司)；水浴控溫?fù)u床(德國(guó)Julabo公司)；。

硒酸根(75.1 μg/g)、亞硒酸根(68.9 μg/g)、砷酸根(0.233 μmol/g)和亞砷酸根(1.011 μmol/g)購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；三價(jià)鉻、六價(jià)鉻的單元素儲(chǔ)備溶液(均為1 000 mg/L，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；四丁基氫氧化銨、乙酸銨、乙二胺四乙酸二鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(色譜純，美國(guó)Tedia公司)。

圖1 As、Se、Cr元素?zé)o機(jī)形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of As，Se，Cr inorganic species standardconcentration:Cr(Ⅲ)，Cr(Ⅵ)，As(Ⅴ) and Se(Ⅳ)are 100 μg/L，As(Ⅲ)and Se(Ⅵ) are 50 μg/L

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理將果汁樣品混合均勻，精確稱取 5 g于離心管中，加入20 mL 10%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液，超聲 10 min，加0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液1 mL，將樣液在60 ℃恒溫水浴搖床上振蕩1 h，10 000 r/min 離心10 min，取上清液用10%甲醇定容至25 mL，取適量過(guò)濾后待測(cè)，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.2儀器條件HPLC條件：Agilent XDB-C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；進(jìn)樣體積50 μL；流動(dòng)相為0.1 mmol/L四丁基氫氧化銨+0.1 mmol/L乙酸銨+10% 甲醇，等度洗脫。

ICP-MS條件：同心霧化器，RF功率1 500 W，載氣流速0.75 L/min，泵速20 r/min，反應(yīng)氣流量0.6 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離模式的選擇

關(guān)于砷、硒等元素的形態(tài)分析，文獻(xiàn)報(bào)道多使用PRP-X100、AS-19等陰離子交換柱進(jìn)行分離[5-11]，但考慮到多元素形態(tài)同時(shí)分析時(shí)，目標(biāo)分析物以多種離子狀態(tài)存在，很難實(shí)現(xiàn)同時(shí)分離，因此本文嘗試采用反相高效液相色譜法。EDTA可以絡(luò)合Cr(Ⅲ)，絡(luò)合物在水溶液中呈陰離子狀態(tài)[12]，而流動(dòng)相四丁基氫氧化銨在水中形成的正離子TBA+可與各種陰離子形成中性“離子對(duì)”，且這些離子對(duì)化合物表現(xiàn)出不同的親脂性，基于C8反相色譜柱對(duì)這些化合物保留能力的不同即可實(shí)現(xiàn)分離測(cè)定。As、Se、Cr元素?zé)o機(jī)形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。

為保證較好的分離度，本實(shí)驗(yàn)選擇在樣液處理時(shí)加入EDTA溶液，而不添加至流動(dòng)相中，原因是當(dāng)EDTA添加到流動(dòng)相時(shí)會(huì)增加離子強(qiáng)度，從而降低分析物的保留[12]，導(dǎo)致Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的峰形變差。在相同色譜條件下，參考文獻(xiàn)[12]，對(duì)比了添加EDTA前后，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)響應(yīng)值的變化，結(jié)果表明EDTA的添加對(duì)其他被分析物基本無(wú)影響。

2.2 流動(dòng)相對(duì)色譜分離的影響

圖2 pH 7.2條件下3種元素形態(tài)化合物標(biāo)液的色譜圖Fig.2 Chromatograms of three element species standard solution under pH 7.2

離子對(duì)色譜中，柱有效容量取決于離子對(duì)試劑，離子對(duì)試劑濃度越大，被分析物的保留越強(qiáng)，因此實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相pH 7.2，離子對(duì)試劑四丁基氫氧化銨(TBAOH)濃度分別為0.05、0.1、0.2 mmol/L時(shí)的出峰情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TBAOH濃度為0.2 mmol/L時(shí)，被分析物的分離度良好，但分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；當(dāng)濃度為0.05 mmol/L時(shí)，被分析物的保留時(shí)間太短，且分離度差；而當(dāng)濃度為0.1 mmol/L時(shí)，被分析物的保留時(shí)間為1.22～1.65 min，且分離度能滿足要求，最終確定TBAOH的最佳濃度為0.1 mmol/L。

有機(jī)試劑可降低流動(dòng)相的極性，影響分析物與離子對(duì)試劑所形成的復(fù)合物在疏水環(huán)境的分配，并能減少柱有效容量；但在高效液相色譜儀與電感耦合等離子體質(zhì)譜儀聯(lián)用時(shí)，較高濃度的有機(jī)溶劑會(huì)造成積碳嚴(yán)重和等離子體熄火，因此本實(shí)驗(yàn)將甲醇體積分?jǐn)?shù)控制在10%以內(nèi)，設(shè)定流動(dòng)相pH 7.2，TBAOH濃度為0.1 mmol/L時(shí)，考察了甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%時(shí)分析物的保留情況。結(jié)果表明：隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，各分析物的保留時(shí)間明顯縮短，主要是因?yàn)榧状寄軌蜃璧K分析物與離子對(duì)試劑結(jié)合，從而影響其在C8柱上的保留?？紤]到分離度與分析時(shí)間，選擇最佳流動(dòng)相為0.1 mmol/L四丁基氫氧化銨+0.1 mmol/L乙酸銨+10%甲醇，該條件下各分析物均可在1～3 min內(nèi)出峰，且分離度滿足要求。

2.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)量條件

普通模式下，選擇豐度最高的硒同位素80Se及52Cr對(duì)目標(biāo)元素進(jìn)行測(cè)定，基線響應(yīng)值達(dá)105cps數(shù)量級(jí)，無(wú)法進(jìn)行正常分析，這主要是因?yàn)?0Se、52Cr、75As分別會(huì)受到40Ar2+、40Ar12C+和40Ar35Cl等多聚離子的干擾。為消除它們的影響，本研究采用甲烷作為反應(yīng)氣的動(dòng)態(tài)反應(yīng)池DRC模式，優(yōu)化了氣體流速和RPq值。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)空白溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，選擇背景等效濃度為10 μg/L 時(shí)為最優(yōu)條件，優(yōu)化后得到監(jiān)測(cè)離子分別為52Cr+、78Se+、75As+，反應(yīng)氣流量0.6 mL/min，RPq為0.45。

2.4 線性范圍與檢出限

將6種形態(tài)化合物配成含Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度范圍分別為5～100、5～100、2～100、2～100、20～100、20～100 μg/L。在最佳的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，以各元素形態(tài)的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，目標(biāo)分析物在上述相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限，Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的檢出限分別為0.34、0.20、0.50、0.40、0.82、0.90 μg/L。以S/N=10計(jì)算得到定量下限分別為0.006、0.003、0.009、0.007、0.014、0.015 mg/kg。

2.5 實(shí)際樣品分析

為驗(yàn)證本方法的實(shí)際應(yīng)用能力，對(duì)不同的果汁樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，蘋(píng)果汁未檢出該6種形態(tài)；藍(lán)莓汁檢出Cr(Ⅲ)和Se(Ⅳ)，含量分別為0.007、0.015 mg/kg；雜糧汁檢出Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)和Se(Ⅳ)3種形態(tài)，含量為0.008～0.034 mg/kg。為考察該方法的準(zhǔn)確性，對(duì)3種果汁樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，幾種元素?zé)o機(jī)形態(tài)的加標(biāo)回收率為79.5%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5.0%，結(jié)果見(jiàn)表1。GB 2762-2017對(duì)果蔬、谷物等食品中總砷、無(wú)機(jī)砷、總鉻的限量在0.2～1.0 mg/kg之間，根據(jù)料液比折算，各檢測(cè)值均低于限量要求。

表1 3種果汁樣品的分析結(jié)果Table 1 Analytical result of three kinds of fruit juice samples

*no detected

3 結(jié) 論

本文建立了同時(shí)分析果汁飲料中Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的離子對(duì)色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法，以0.1 mmol/L四丁基氫氧化銨、0.1 mmol/L乙酸銨和10%甲醇為流動(dòng)相，并調(diào)整pH值至7.2，利用C8色譜柱對(duì)該6種無(wú)機(jī)形態(tài)化合物進(jìn)行分離，解決了離子色譜中不同元素形態(tài)因離子狀態(tài)不同而無(wú)法同時(shí)分析的問(wèn)題。方法檢出限為0.20～0.90 μg/L，RSD均小于5.0%，實(shí)際樣品分析顯示富硒藍(lán)莓汁中有微量的Cr(Ⅲ)和Se(Ⅳ)檢出，雜糧汁有Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)和Se(Ⅳ)檢出，各無(wú)機(jī)形態(tài)含量水平低無(wú)風(fēng)險(xiǎn)。該方法回收率高、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，可為元素形態(tài)分析提供借鑒。