有氧運動調(diào)控肥胖小鼠棕色脂肪組織炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達及通路的研究

付鵬宇 龔麗景 朱镕鑫 梅濤 胡揚

北京體育大學（北京100084）

由脂肪細胞增大、過多堆積和分泌功能異常而誘發(fā)的肥胖往往會引起免疫細胞在脂肪處形成細胞浸潤，并隨著細胞因子的分泌將促炎因子釋放給其它組織，加劇代謝紊亂[1]，導致機體處于炎癥狀態(tài)，并由此引發(fā)糖尿病和心血管疾病。對肥胖機制的探索多以脂肪細胞為中心，其中脂肪組織又分為儲存能量的白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）和燃燒脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A）以產(chǎn)熱的棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）。而有氧運動不僅可以通過減少WAT的堆積，增強BAT的產(chǎn)熱耗能以緩解機體的肥胖狀態(tài)，也可通過降低WAT炎癥細胞浸潤[2]和循環(huán)系統(tǒng)中促炎因子的水平[3，4]，改善肥胖所致的機體炎癥反應(yīng)。近來研究發(fā)現(xiàn)，BAT對肥胖誘導的炎癥反應(yīng)有較強的抵抗性[5]。那么有氧運動是否通過激活BAT中相關(guān)信號通路而調(diào)控肥胖機體的免疫細胞狀態(tài)和炎癥因子的分泌，以抑制肥胖所致的炎癥狀態(tài)？

mRNA表達譜芯片的原理是將被不同熒光分子標記的處理組及對照組樣品與固定于載體芯片上已知序列的核酸探針進行雜交，通過計算兩組雜交熒光信號強度的比值，來反應(yīng)表達水平存在較大差異的基因[6]。并通過生物信息學處理，將差異表達基因進行分類（聚類分析）、功能注釋（gene ontology，GO）[包括細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學過程（biological process，BP）分析]和信號通路（Pathway）富集度統(tǒng)計分析，從而高效全面地探究某組織或細胞在干預前后基因變化的情況。雖有研究提示了BAT在抑制肥胖機體炎癥狀態(tài)的作用，但其中的免疫相關(guān)信號通路還未被系統(tǒng)研究過，且有氧運動對BAT免疫相關(guān)功能的影響也未被全面探究，因此mRNA表達譜芯片可作為探究此問題的一種研究手段。

綜上，本研究通過mRNA表達譜芯片掃描正常與肥胖小鼠、有氧運動干預后肥胖小鼠的BAT，篩選差異表達基因、分析差異基因的生物功能和富集的炎癥相關(guān)信號通路，以探究有氧運動通過調(diào)控BAT而發(fā)揮抵抗肥胖機體炎癥反應(yīng)的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

離乳雄性C57BL/6J小鼠30只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（許可編號：SCXK-（京）2015-0004）。所有小鼠均單籠飼養(yǎng)，在北京體育大學動物實驗室[溫度（22±2）℃，濕度40%～70%，光照12 h/天，許可編號：SYXK（京）2011-0034]內(nèi)進行。本研究已獲得北京體育大學運動科學倫理委員會批準（批準號：2015040）。

將30只小鼠隨機分為普通飲食對照組（NC，n=8），喂以普通維持飼料（軍事醫(yī)學科學院大小鼠維持飼料）；高脂飲食組（HD，n=22），喂以高脂飼料（含脂量40%kcal，美國Research Diet公司D12109C）。飼喂8周高脂飼料建立肥胖模型后（以HD組大于NC組平均體重的20%作為肥胖模型建立成功判斷標準，淘汰未達標準個體），將HD組隨機分為：肥胖安靜對照組（HC，n=8）和肥胖運動組（HE，n=8），均繼續(xù)飼喂高脂飼料。每周記錄各組小鼠體重和攝食量。

1.2 運動方案

NC組和HC組小鼠不施加運動干預，自由飲食和飲水。HE組的運動方案設(shè)定為坡度0°，速度10 m/min，持續(xù)1 h的跑臺訓練，每天1次，每周6天，持續(xù)4周。

1.3 取材方法

動物干預4周后，禁食12 h，用2%戊巴比妥鈉溶液以40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，心臟取血放于抗凝管內(nèi)，4℃，3000轉(zhuǎn)/min離心10 min，收集血漿。取肩胛處BAT，放入RNA later保存液而后置于4℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)置于－20℃冰箱保存。

1.4 血液生化指標測試

使用全自動生化分析儀（日立7020）測試血漿中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（cholesterol，CHO）和血糖（glucose，GLU）水平（試劑盒：中生北控0220、0180、0230）。

1.5 總RNA的提取和芯片的制備

采用AmbionmirVanamiRNA Isolation Kit提取BAT的總RNA，再采用NucleoSpin?RNA clean-up試劑盒（MACHEREY-NAGEL，Germany）對總RNA進行過柱純化，最后用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。使RNA純度（A260/280≥1.90）、總量（≥10μg）和完整性均滿足表達譜芯片檢測要求。將所提RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行KLENOW酶標記，而后純化后抽干。標記的DNA溶于雜交液中[2X GExHyb Buffer（HI-RPM），25%甲酰胺]，于45℃雜交過夜。雜交結(jié)束后清洗，玻片甩干后即可用于掃描。因C57BL/6J小鼠屬于近交系實驗動物，個體間遺傳差異小[7]，每組隨機測試3只動物樣本即可滿足基因芯片統(tǒng)計學分析要求[8-10]。

1.6 芯片圖像采集和數(shù)據(jù)分析

利用 Agilent公司的 Mouse（V2）Gene Expression Microarray，8x60K mRNA單通道表達譜芯片檢測小鼠物種BAT基因表達情況，芯片由北京博奧晶典生物有限公司提供。芯片用Agilent G2565CA Microarray Scan?ner進行掃描，得到雜交圖片，并將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。原始數(shù)據(jù)輸入GeneSpring GX軟件中，對信號值進行歸一化處理。錯誤檢出率（false discovery rate，F(xiàn)DR）控制在5%以內(nèi)，并以1.5倍標準[FC（abs）＞1.5]篩選差異表達基因[8]。利用Cluster3.0軟件對具有表達信號的基因進行聚類分析。采用SAM軟件進行差異表達基因的分析，對所篩選的差異基因用DAVID軟件（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進行功能注釋（gene ontology，GO）和信號通路（Pathway）富集度統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。建模后3組體重數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。運動后體重、血液生化指標和基因芯片數(shù)據(jù)采用HC組與NC組相比，HE組與HC組相比，各進行獨立樣本t檢驗[11]。結(jié)果用平均值±標準差表示。P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 干預前后各組小鼠的體重和攝食量變化

各組小鼠初始體重無顯著性差異（初始體重為8.2±0.1g）；如表1示，飼喂8周高脂飼料構(gòu)建的肥胖模型成功，HE組運動4周后體重顯著低于HC組（P＜0.05）；與HC組相比，運動干預前后HE組每周平均攝食量沒有顯著差異（數(shù)據(jù)略）。

表1 干預前后各組小鼠體重變化情況（g）（n=8）

2.2 各組小鼠血清生化指標結(jié)果

HC組血清的TG、CHO和GLU水平均顯著高于NC組（P＜0.05）；HE組的血清TG和CHO與HC組相比無顯著性差異；HE組血糖水平顯著低于HC組（P＜0.05），如表2示。

表2 各組小鼠血清TG、CHO、GLU水平（n=8）

2.3 芯片結(jié)果

2.3.1 差異基因及GO分析

分析結(jié)果顯示，HC組與NC組相比，發(fā)生上調(diào)的基因有802個，下調(diào)的基因有1157個；HE組與HC組相比，發(fā)生上調(diào)的有859個，下調(diào)的基因有576個。利用GO數(shù)據(jù)庫（http://www.geneongoloty.org/）對差異基因進行分子注釋分析，并根據(jù)生物學過程（biological pro?cess，BP）進行分類。與NC組相比，HC組上調(diào)差異基因種類主要涉及免疫系統(tǒng)進程、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等功能，下調(diào)種類主要涉及脂質(zhì)代謝、氧化還原和磷酸化等功能；與HC組相比，HE組上調(diào)的差異基因主要涉及糖脂代謝過程和氧化還原過程等功能，下調(diào)種類主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、凋亡過程和細胞周期等功能，見表3。根據(jù)差異基因所富集的生物過程和其差異倍數(shù)，代表性地選取了6個與炎癥反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵差異基因：Mpeg1、Mmd、Ccl28、Il6ra、Tnfrsf1b、Lepr。HC較NC組出現(xiàn)顯著性上調(diào)，且上調(diào)倍數(shù)達1.5倍的基因有Mpeg1、Mmd、Ccl28、Tnfrsf1b（P＜0.05或P＜0.01）；HE較HC組出現(xiàn)顯著性下調(diào)，且下調(diào)倍數(shù)達1.5倍的基因有Mpeg1、Mmd和Ccl28（P＜0.05或P＜0.01），見表4。

表3 差異基因所富集的主要生物學過程

表4 關(guān)鍵差異基因信息及差異倍數(shù)

2.3.2 差異基因的Pathway分析

利用 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge?nomes）數(shù)據(jù)庫分析差異基因所富集的信號通路（Path?way）。各組中發(fā)生顯著上下調(diào)的通路如表5所示，HC組較NC組上調(diào)的通路有17條，其中關(guān)鍵的上調(diào)通路為Jak-STAT信號通路；下調(diào)的通路有11條，關(guān)鍵下調(diào)通路為胰島素信號通路。HE組較HC組相比，上調(diào)的通路有8條，關(guān)鍵通路為胰島素信號通路；下調(diào)的通路有7條，關(guān)鍵通路為Jak-STAT信號通路、ErbB信號通路和TGF-β信號通路。

表5 差異基因所富集的信號通路

注：1：Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinases/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）；2：V-Erb-B2禽紅系細胞白血病病毒癌基因同源物（V-Erb-B2 Avian Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog，ErbB）；3：轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-beta1，TGF-β）。表中顯示的是各組的差異基因所富集的信號通路，其中↑表示上調(diào)，↓表示下調(diào)，下劃線表示關(guān)鍵信號通路。

3 討論

3.1 肥胖機體BAT中的炎癥狀態(tài)

本研究建立肥胖模型后，繼續(xù)高脂膳食4周，HC組小鼠的體重和血脂血糖水平高于NC組。芯片結(jié)果也顯示，HC組脂代謝水平顯著降低，Ⅰ型糖尿病信號通路被激活；同時，肥胖會顯著激活BAT中的炎癥反應(yīng)過程，提高了免疫系統(tǒng)進程、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答功能，激活了白細胞跨內(nèi)遷移、趨化因子信號通路、Jak-STAT信號通路等炎癥反應(yīng)相關(guān)通路。

激活的巨噬細胞浸潤到組織中是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵，而BAT擁有抑制巨噬細胞炎性特征的能力，WAT則表現(xiàn)出增強炎癥反應(yīng)的特點[5]。雖然，肥胖機體BAT炎癥狀態(tài)低于WAT，但仍高于正常機體[12]。本研究的芯片結(jié)果也證實了這一觀點，肥胖機體Mpeg1表達增加，提示巨噬細胞浸潤啟動了BAT的慢性炎癥過程，并刺激BAT釋放IL-6、TNF-α和瘦素（分別對應(yīng)Il6ra、Tn?frsf1b和Lepr基因）等促炎癥因子，且BAT中具有誘導單核細胞向巨噬細胞轉(zhuǎn)化功能的Mmd基因和趨化因子Ccl28基因[又稱為粘膜相關(guān)上皮趨化因子（muco?sae-associated epithelia chemokine，MEC）][13，14]在肥胖機體中表達增加。另一方面，肥胖機體中炎性因子的上調(diào)反過來又會降低BAT的活性，炎癥因子的釋放和補體系統(tǒng)的激活會增加瘦素的分泌，而瘦素又會使促炎因子聚集至炎癥部位，造成惡性循環(huán)。該過程還與自由基的生成有關(guān)，進而誘發(fā)BAT特異性基因的表達減少[15]，降低BAT的活性。

3.2 運動調(diào)控BAT發(fā)揮抗炎作用

本實驗4周有氧運動后，BAT中炎癥反應(yīng)相關(guān)基因Mpeg1、Mmd、Ccl28出現(xiàn)下調(diào)，且由肥胖所增加的諸如免疫系統(tǒng)進程、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等生物學過程及趨化因子、補體系統(tǒng)等信號通路未見繼續(xù)上調(diào)；同時與促炎因子相關(guān)的Il6ra、Tnfrsf1b和Lepr6也出現(xiàn)下調(diào)。推測有氧運動通過激活BAT調(diào)控炎癥反應(yīng)的原因可能為：（1）運動可調(diào)控脂解速率：FA釋放增加可刺激巨噬細胞的浸潤[16]，而BAT具有較高的β氧化能力，可以快速動員血液中的FA以供有氧運動時的能量消耗，以使局部FA釋放入血的速率減慢[17]；（2）運動可調(diào)控免疫細胞狀態(tài)：運動可通過激活BAT提高其產(chǎn)熱性能，誘導巨噬細胞處于靜息狀態(tài)，創(chuàng)造局部低炎性的細胞環(huán)境[5，18]；同時運動所誘導的去甲腎上腺素等激素的增加可在重塑BAT免疫細胞（B細胞）的表型中發(fā)揮重要作用[19]；（3）運動可調(diào)控炎癥因子的分泌：運動通過提高交感神經(jīng)興奮性而抑制BAT中促炎因子瘦素的表達[15]；（4）運動可改善氧化應(yīng)激狀態(tài)：肥胖機體活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增多可促進炎癥反應(yīng)的進程[20]，而規(guī)律的有氧運動可通過改善機體的糖脂代謝，促進BAT中氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡以改善炎癥狀態(tài)[21]。

Pathway結(jié)果顯示，運動干預后，機體多條炎癥相關(guān)通路發(fā)生改變，以其中Jak-STAT、ErbB和TGF-β三條下調(diào)和Insulin一條上調(diào)的信號通路為例初步闡釋運動通過調(diào)控BAT以發(fā)揮抗炎作用的可能機制。

3.2.1 ErbB信號通路

神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1（Neuregulin1，NRG1）通過與表皮生長因子受體ErbB3/4結(jié)合，介導ErbB2受體的活化，進一步激活部分細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）和/或PI3K（Akt）通路而發(fā)揮促進血管新生等作用[22]，而大量的新生血管可將促炎因子等轉(zhuǎn)運至循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)，加劇機體代謝性病變的進程。ErbB2受體抑制劑PD168393可阻斷NRG1-ErbB2信號通路以抑制炎癥介質(zhì)IL-1β的釋放[23]。本研究顯示，有氧運動通過下調(diào)BAT中ErbB信號通路（NRG-1→ErbB2→ERK/PI3K（Akt））而發(fā)揮抗炎的作用。

3.2.2 JAK-STAT信號通路

JAK-STAT3通路可在下丘腦被瘦素受體激活而調(diào)控糖脂代謝，促進BAT白色化，參與炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答[24，25]。IL-6與受體結(jié)合后激活JAK激酶而上調(diào)JAKSTAT通路[26]。細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子-3（suppres?sor of cytokine signaling 3，SOCS-3）是JAK-STAT下游的基因，7周的游泳訓練可降低SOCS-3 mRNA水平，預防瘦素抵抗的發(fā)生[27]。本研究結(jié)果中，運動干預后BAT中JAK-STAT信號通路及Il6ra、Lepr基因均出現(xiàn)下調(diào)，提示運動通過介導JAK-STAT信號通路（JAK→STAT3→SOCS-3）而激活了肥胖機體中BAT的抗炎作用。

3.2.3 TGF- β信號通路

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路（TGF-β→Smad2/3）作為一條重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，對免疫細胞具有多種生物學效應(yīng)。TGF-β在炎癥介質(zhì)[IL、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nu?clear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）]及ROS作用下被激活[28]，通過自分泌或旁分泌調(diào)節(jié)巨噬細胞等免疫細胞的趨化、活化和生存，參與免疫反應(yīng)進程。Smad是TGF-β/Smad信號通路中的自身負反饋調(diào)節(jié)信號[29]，Smad3在TGF-β1介導抑制巨噬細胞活化中發(fā)揮重要作用，同時，也可單獨發(fā)揮抑制巨噬細胞標記基因表達的作用。6周中等強度有氧運動可以有效抑制TGF-β經(jīng)典（Smad依賴性）及非經(jīng)典（MAPKs）通路[28]。本研究結(jié)果也顯示有氧運動可通過下調(diào)BAT中TGF-β信號通路而抵抗炎癥反應(yīng)。

3.2.4 Insulin信號通路

肥胖機體血漿游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）水平的提高，會導致代謝超負荷和脂質(zhì)不完全氧化，累積的代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺（Ceramide）可激活蛋白磷酸酶2A去磷酸化抑制PKB/Akt，破壞Insulin信號通路[30]。其中，飽和FA作為一種炎癥介質(zhì)，可激活脂肪組織巨噬細胞中的NF-κB，刺激巨噬細胞趨化作用和增加IR水平[31]。有氧運動可顯著改善機體的糖脂代謝狀況，提高胰島素敏感性，激活BAT活性以消耗肥胖機體過多的FFA，上調(diào)Insulin信號通路[（INS→IR（insulin recep?tor）→IRS（insulin receptor substrate）→PI3K→AKT/PKB）]而抵抗炎癥狀態(tài)。

4 結(jié)論

4周的有氧運動可通過調(diào)控BAT中Jak-STAT、ErbB、TGF-β和Insulin等信號通路及一系列生物學過程而發(fā)揮抵抗機體免疫細胞和促炎因子相關(guān)基因表達的作用，改善并增強BAT的抗炎作用，進而改善肥胖機體的炎癥狀態(tài)。