酶法制備玉米芯阿魏酰低聚糖的工藝條件優(yōu)化

孫元琳，白宇仁，王曉聞，周素梅

（1.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193）

玉米芯是玉米加工產(chǎn)業(yè)的重要副產(chǎn)物之一。玉米芯作為一種農(nóng)業(yè)廢棄物，曾經(jīng)絕大多被燒掉或簡單處理當(dāng)做動(dòng)物飼料食用，造成很大程度的資源浪費(fèi)[1]。玉米芯不溶性膳食纖維含量較高，主要為阿拉伯木聚糖[2]。此外，玉米芯中還含有豐富的酚酸類物質(zhì)。Torre P等[3]研究表明，玉米芯中含有的酚酸物質(zhì)主要是阿魏酸和對(duì)香豆酸。玉米芯中的阿魏酸含量（1.4%）高于麥麩（0.4%～0.7%）、蔗渣（1%）、小麥秸稈（1.2%）等，是大多數(shù)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品中最有潛力的阿魏酸資源[4]。

阿魏酰低聚糖（feruloylated oligosaccharides，F(xiàn)Os）又稱為阿魏酸糖酯，低聚糖阿魏酸酯，由結(jié)合態(tài)阿魏酸與糖羥基通過酯鍵連接而成，具有抗氧化、抗衰老、促進(jìn)益生菌增殖、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等生理活性[5]。目前，通過對(duì)禾本科植物不溶性膳食纖維進(jìn)行可控性酶解，可以獲得阿魏酰低聚糖。Smith M M等[6]最早采用纖維素酶處理小麥麥麩得到阿魏酰低聚糖。胡楠楠等[7]采用木聚糖酶水解米糠制備出阿魏酰低聚糖。而關(guān)于從玉米芯中制備阿魏酰低聚糖卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過生物酶法制備玉米芯阿魏酰低聚糖，并結(jié)合響應(yīng)面分析探討其最佳工藝條件，為玉米資源的綜合利用和有效增值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

玉米芯：市售；木聚糖酶（2.5 U/mg）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；木糖標(biāo)準(zhǔn)品（xylose，Xyl）：美國Sigma公司；低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品（xylooligosaccharide，XOS）：山東龍力生物科技股份有限公司；耐高溫α-淀粉酶（酶活≥4 U/mg）、中性蛋白酶（酶活≥60 U/mg）、糖化酶（酶活≥100 U/mg）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；3-（N-瑪琳代）丙磺酸[3-（N-Malin substituted）propane sulfonic acid，MOPS]、二苯胺、冰乙酸、乙酸乙酯、丙酮、氨水均為分析純。

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；Cary5000紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)：美國安捷倫（Agilent）公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米芯阿魏酰低聚糖酶法制備工藝流程

玉米芯→粉碎過篩→高壓蒸汽處理（121℃，45min）→依次加入耐高溫α-淀粉酶，糖化酶和蛋白酶（調(diào)節(jié)相應(yīng)的pH值和溫度）酶水解→攪拌→高溫滅酶（100℃，10 min）→離心（3 000 r/min，15 min）→取沉淀物→蒸餾水洗滌→無水乙醇洗滌→真空干燥（45℃）→玉米芯不溶性膳食纖維。

玉米芯不溶性膳食纖維→加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和木聚糖酶→酶解→滅酶（100℃，10 min）→離心（3 000 r/min，15 min）→取上清液→抽濾→濃縮→阿魏酰低聚糖酶解液。

1.2.2 酶解液FOs含量測(cè)定

取酶解液0.5mL，與4.5mLMOPS緩沖液（100mmol/L，pH6.0）充分混合，分別在286 nm和325 nm波長處測(cè)定酶解液的吸光度值（A286和A325），按下式計(jì)算酶解液中阿魏酰低聚糖含量[8]。

式中：ε286=141 76 L/（mol·cm），ε325=103 50 L/（mol·cm），ε′286=124 65L/（mol·cm），ε′325=19345L/（mol·cm）。

1.2.3 薄層層析

精確吸取6 μL標(biāo)準(zhǔn)樣液（1%木糖、1%低聚木糖）和酶解液點(diǎn)于GF254硅膠板上，放入層析缸中進(jìn)行展開，展開劑為乙酸乙酯∶甲醇∶蒸餾水∶氨水=5∶9∶1∶1.5（體積比）。展開結(jié)束后，用噴霧器朝薄層板上均勻噴灑苯胺-二苯胺-磷酸-丙酮試劑，105℃條件下顯色10 min[9]。通過觀察標(biāo)準(zhǔn)品與酶解液的斑點(diǎn)顏色和位置，對(duì)酶解液中低聚糖聚合度進(jìn)行分析。

1.2.4 單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

設(shè)定底物濃度50 g/L、酶解時(shí)間18 h、pH5.0、酶解溫度 50℃，加酶量分別控制為 21.4、42.8、64.2、85.6、107、128.4 mg/L；設(shè)定木聚糖酶添加量 85.6 mg/L、pH5.0、酶解溫度50℃、底物濃度50 g/L，酶解時(shí)間分別控制為 6、9、12、15、18、21 h；設(shè)定木聚糖酶添加量85.6 mg/L、pH5.0、酶解溫度 50℃、酶解時(shí)間 18 h，底物濃度分別控制為 30、50、70、90、110、130 g/L；設(shè)定木聚糖酶添加量85.6 mg/L、底物濃度50 g/L、pH5.0、酶解時(shí)間 18 h，酶解溫度分別控制為 35、40、45、50、55、60 ℃；設(shè)定木聚糖酶添加量85.6 mg/L、底物濃度50 g/L、酶解時(shí)間18 h、酶解溫度50℃，pH值分別控制為3、3.5、4、4.5、5、5.5。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以加酶量、酶解時(shí)間、底物濃度、酶解溫度、pH值為試驗(yàn)因素，并以-1、0、1為自變量的低、中、高水平，以FOs含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)五因素三水平試驗(yàn)。因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

各指標(biāo)均做3次重復(fù)，運(yùn)用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SigmaPlot10.0軟件進(jìn)行繪圖，響應(yīng)面分析由Design Expert 8.0.6軟件完成。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factor and level used in response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 木聚糖酶添加量對(duì)FOs含量的影響

木聚糖酶添加量對(duì)FOs含量的影響見圖1、圖2。

圖1 木聚糖酶添加量對(duì)FOs含量的影響Fig.1 Effects of xylanse amount on the production of FOs

圖2 不同木聚糖酶添加量酶解液的薄層層析圖Fig.2 TLC of enzymatic hydrolysate of different xylanase amount

從圖1可以看出，隨著反應(yīng)體系中木聚糖酶添加量的增大，F(xiàn)Os的含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)酶量達(dá)到85.6 mg/L，F(xiàn)Os的含量增長緩慢。原因在于，當(dāng)?shù)孜餄舛炔蛔兊那闆r下，F(xiàn)Os的含量會(huì)隨著木聚糖酶添加量的增加而增加，但是，較高的酶添加量會(huì)造成酶的浪費(fèi)損失和反應(yīng)過度導(dǎo)致阿魏酰低聚糖的分解。當(dāng)酶添加量達(dá)到一定程度后，阿魏酰低聚糖的溶出達(dá)到平衡狀態(tài)，再增加酶量，底物已經(jīng)充分反應(yīng)而不利于阿魏酰低聚糖的溶出。結(jié)合薄層層析圖來看，隨著酶量的增加，薄板的顏色逐漸加深，說明酶解液中FOs含量逐漸升高。加酶量85.6 mg/L時(shí)薄板上出現(xiàn)了明顯的木糖組分但顏色較淺。加酶量107 mg/L、128.4 mg/L木糖組分顏色較深，說明其中木糖含量高、酶解過度。結(jié)合FOs含量變化和酶解液中低聚糖聚合度，同時(shí)考慮節(jié)約成本，選取的加酶量進(jìn)一步優(yōu)化的范圍為64.2 mg/L～107 mg/L。

2.1.2 底物濃度對(duì)FOs含量的影響

底物濃度對(duì)FOs含量的影響見圖3。

圖3 底物濃度對(duì)FOs含量的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on the production of FOs

從圖3可以看出，隨著反應(yīng)體系中底物濃度的增加，F(xiàn)Os的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。原因在于，隨著底物濃度的升高，底物中可被利用的阿拉伯木聚糖含量升高，酶與底物可以充分接觸反應(yīng)，使反應(yīng)體系中FOs大量溶出；但當(dāng)?shù)孜锾砑恿砍^一定限度時(shí)，反應(yīng)體系會(huì)變得非常黏稠，酶與底物結(jié)合受限甚至底物會(huì)抑制酶的部分活性，底物中阿拉伯木聚糖不能充分水解，故FOs的含量降低[10]。由此初步確定酶法制備FOs的優(yōu)化范圍為90 g/L～130 g/L。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)FOs含量的影響

酶解時(shí)間對(duì)FOs含量的影響見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)FOs含量的影響Fig.4 Effects of time on the production of FOs

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的進(jìn)行，F(xiàn)Os含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。原因在于，酶與底物充分反應(yīng)需要一定的時(shí)間，達(dá)到最適時(shí)間時(shí)，F(xiàn)Os含量達(dá)到最高值0.252 5 mmol/L。超過最適時(shí)間后，F(xiàn)Os會(huì)進(jìn)一步分解產(chǎn)生木糖，導(dǎo)致FOs含量下降。故確定酶法制備FOs的進(jìn)一步優(yōu)化范圍為12 h～18 h。

2.1.4 pH值對(duì)FOs含量的影響

pH值對(duì)FOs含量的影響見圖5。

每種酶都有其最適宜的pH值，在最佳pH值條件下，酶與底物可以充分反應(yīng)結(jié)合，此時(shí)酶活力最高[11]。在非最佳pH值條件下，酶活性會(huì)降低甚至失活，相應(yīng)的FOs含量也會(huì)降低。如圖5所示，在pH3.5條件下，F(xiàn)Os含量最高，說明木聚糖酶在pH3.5時(shí)活力最強(qiáng)，條件最適宜。由此，確定進(jìn)一步優(yōu)化的范圍為pH3～4。

2.1.5 酶解溫度對(duì)FOs含量的影響

酶解溫度對(duì)FOs含量的影響見圖6。

圖6 酶解溫度對(duì)FOs含量的影響Fig.6 Effects of temperature on the production of FOs

從圖6可以看出，當(dāng)酶解溫度小于55℃時(shí)，隨著溫度的升高，F(xiàn)Os的含量上升，55℃以后，隨著溫度的上升，F(xiàn)Os的含量降低。原因在于溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)速度會(huì)加快，滲透、溶解、擴(kuò)散速度相應(yīng)提高，酶與底物可以充分接觸，故FOs含量升高[12]。但在酶解反應(yīng)過程中，酶存在最適溫度，當(dāng)超過其最適溫度時(shí)，酶活性會(huì)降低甚至喪失，使FOs的含量降低。由此，確定進(jìn)一步優(yōu)化的溫度范圍為50℃～60℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box－Behnken程序分別考察影響玉米芯阿魏酰低聚糖酶解工藝的5個(gè)主要因素，即加酶量（A）、酶解時(shí)間（B）、底物濃度（C）、pH值（D）、酶解溫度（E），設(shè)計(jì)五因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。以阿魏酰低聚糖含量為響應(yīng)值，利用Design－Expert8.0.6軟件進(jìn)行優(yōu)化分析，試實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析見表3，各響應(yīng)面結(jié)果見圖7（不顯著圖略）。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

續(xù)表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Design and results of response surface experiments

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到A（木聚糖酶添加量）、B（酶解時(shí)間）、C（底物濃度）、D（pH）、E（酶解溫度）多項(xiàng)回歸方程為

圖7 以阿魏酰低聚糖含量為指標(biāo)的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots on the production of FOs

由表3可知回歸模型極顯著（P＜0.000 1），而模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明模型選擇合適。同時(shí)，該回歸模型系數(shù)R2和調(diào)整R2分別是0.990 8和0.983 5，說明該模型的擬合程度較好，因此利用該模型預(yù)測(cè)玉米芯阿魏酰低聚糖酶解工藝是切實(shí)可行的。由顯著性和F值可知，玉米芯阿魏酰低聚糖酶解工藝的影響因素主次順序?yàn)槊附鉁囟?酶解時(shí)間>pH值>加酶量>底物濃度。

響應(yīng)面曲線梯度反映各因素對(duì)阿魏酰低聚糖含量的影響大小，曲線越陡表明該因素對(duì)阿魏酰低聚糖含量影響越大。由圖7可知，加酶量和底物濃度、加酶量和pH值、pH值和酶解溫度之間都存在顯著的交互作用（P<0.05）。其中，pH值和酶解溫度交互最為顯著，隨著這兩個(gè)因素的增大FOs含量有明顯的增加。這與表3回歸分析結(jié)果相符。

運(yùn)用響應(yīng)面Design Expert 8.0.6軟件，結(jié)合回歸模型和響應(yīng)面圖分析得到玉米芯阿魏酰低聚糖最佳酶解工藝條件為：加酶量89.64 mg/L、酶解時(shí)間16.41 h、底物濃度111.40 g/L、pH3.65、酶解溫度53.09℃，預(yù)測(cè)玉米芯阿魏酰低聚糖的含量為0.771 54 mmol/L。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整為加酶量89.7 mg/L、酶解時(shí)間16 h、底物濃度111 g/L、pH3.65、酶解溫度53℃，得到玉米芯阿魏酰低聚糖的含量為0.764 8 mmol/L，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.87%，表明在該試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖碌玫降淖罴压に嚄l件具有較高的可靠性。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到酶法制備玉米芯阿魏酰低聚糖的最佳工藝條件為：加酶量89.7 mg/L、酶解時(shí)間 16 h、底物濃度 111 g/L、pH3.65、酶解溫度53℃。在此優(yōu)化條件下FOs的含量可達(dá)到0.764 8 mmol/L。