五味子多糖的酶解輔助提取及其對(duì)小鼠腸道菌群的影響

王琳，高辰哲，崔石陽(yáng)，劉冬，劉丹儀，韓建春，2，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱150030）

五味子一般指木蘭科植物五味子的成熟果實(shí)，具有抗疲勞[1]、鎮(zhèn)痛[2]、抗氧化[3]與調(diào)節(jié)腸道菌群[4]等生物功效，為中醫(yī)常用滋陰強(qiáng)腎藥，廣泛應(yīng)用于肝炎、神經(jīng)衰弱等病癥的治療[5]。五味子中含有多糖、木質(zhì)素、揮發(fā)油等生物活性成分[6]，其中多糖已經(jīng)有研究證實(shí)具有多種功效[7]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、抗血脂、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)等功效，對(duì)多糖的提取和活性研究成為了新的熱點(diǎn)[8]。傳統(tǒng)多糖的提取方法以水提醇沉為主，但存在提取率較低的缺陷。復(fù)合酶法提取多糖因其破壞細(xì)胞壁效果好，提取條件溫和，正逐漸受到廣大研究者的重視，將復(fù)合酶法應(yīng)用于五味子多糖的提取目前研究較少。

腸道內(nèi)的菌群具有輔助營(yíng)養(yǎng)吸收、生物拮抗、免疫調(diào)節(jié)等作用，可以為宿主的腸道形成一道天然屏障[9]。有研究表明，多糖可以促進(jìn)腸道中有益菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，抑制有害菌的生長(zhǎng)[10]。五味子多糖已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤[11]、降脂[12]、抗氧化[13]等功能，而五味子多糖能否對(duì)腸道菌群產(chǎn)生影響目前尚無(wú)明確報(bào)道。

本研究采用復(fù)合酶輔助提取五味子多糖，優(yōu)化五味子多糖的提取條件，并通過(guò)建立小鼠腸道菌群紊亂模型，對(duì)比不同劑量五味子多糖的攝入對(duì)小鼠腸道菌群的影響，初步揭示五味子多糖對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，為其在腸道紊亂防治方面的應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子：黑龍江省北安市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

石油醚、苯酚、濃硫酸、氯仿：盛達(dá)生化科技有限公司；鹽酸林可霉素注射液：河南福森藥業(yè)有限公司；BBL瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、Pfizer腸球菌選擇性瓊脂、MRS瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

木瓜蛋白酶（活力50 000 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；果膠酶（20 000 U/g）、纖維素酶（活力5 000 U/g）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；3種酶按質(zhì)量比1∶1∶1混合成復(fù)合蛋白酶。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP－9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、LDZX－50 KB立式壓力蒸汽滅菌器、LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；FD-1型冷凍干燥機(jī)：上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；JD500-2型電子天平：沈陽(yáng)天平儀器有限公司；TGL-16 C型高速離心機(jī)：江蘇牡丹離心機(jī)制造有限公司；SW-CJ-1 F超凈工作臺(tái)：蘇州江東精密儀器有限公司；索氏抽提器：上海比朗儀器制造有限公司；UV-2401型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；GFSJ-8高速粉碎機(jī)：安丘市經(jīng)欣粉體加工設(shè)備有限公司；HYQX-II厭氧培養(yǎng)箱：寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 五味子多糖的提取

選取干燥的成熟五味子果實(shí)，使用高速粉碎機(jī)粉碎，40目篩網(wǎng)過(guò)篩得五味子干粉。使用石油醚索式抽提12 h后取出，將溶劑揮發(fā)干凈，得到預(yù)處理的脫脂樣品。各組樣品取5 g脫脂樣品，加入蒸餾水調(diào)節(jié)濃度達(dá)0.05 g/mL，在攪拌條件下，各組使用檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖溶液調(diào)節(jié)不同的pH值，注意調(diào)節(jié)過(guò)程緩慢攪拌，保證最終pH值的穩(wěn)定準(zhǔn)確。各組分別添加相應(yīng)體積的復(fù)合酶液，在一定溫度下600 r/min勻速攪拌指定時(shí)間。加入溶液體積3%的雙氧水4℃靜置脫色處理一夜，使用截留分子量為3 600 u的透析袋4℃透析48 h，透析液冷凍干燥得到五味子多糖凍干粉。以提取溫度、提取時(shí)間、提取pH值、復(fù)合酶添加量為主要因素變量，經(jīng)過(guò)單因素初篩后進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.4 多糖含量與得率的測(cè)定

使用徐世忱等[14]的苯酚－硫酸法并做部分改動(dòng)。取2 mL樣液（若檢測(cè)時(shí)吸光值超過(guò)0.9則將樣品按一定比例稀釋至2 mL）依次加入1 mL含6%苯酚的乙醇溶液、5 mL濃硫酸，常溫靜置10 min，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量濃度與吸光度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總糖含量。

采用3，5－二硝基水楊酸比色法[15]，取2 mL樣液（若吸光值超過(guò)0.9，則按一定比例稀釋至2 mL）至25 mL具塞試管中，加入2 mL含有3，5－二硝基水楊酸的顯色劑，在沸水浴中加熱2 min后迅速冷卻，加水至刻度混勻，測(cè)定在波長(zhǎng)540 nm下的吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算還原糖含量。

多糖含量/mg=總糖含量（mg）－還原糖含量（mg）多糖提取率/%=樣品中多糖含量（mg）/樣品質(zhì)量（mg）×100

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物處理

采用同一批次、健康的昆明小鼠（KM mice，品系編碼202）120只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，5周齡～8周齡，雄性，體重18 g～22 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、紊亂自然恢復(fù)組、多糖低劑量干預(yù)組、多糖中劑量干預(yù)組及多糖高劑量干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，紊亂自然恢復(fù)組和各多糖干預(yù)組使用300 mg/mL鹽酸林可霉素灌胃，每天灌胃2次，每次0.3 mL，持續(xù)3 d，建立腸道菌群紊亂模型，空白組使用相同體積的生理鹽水灌胃[16]。小鼠在實(shí)驗(yàn)期間均自由采食、取水，按照表1方案，每天定時(shí)對(duì)各組小鼠灌胃持續(xù)14 d，不同劑量的多糖使用生理鹽水預(yù)先溶解，當(dāng)天現(xiàn)用現(xiàn)配。

表1 小鼠處理方案Table 1 Treatment of mice

1.6 樣品的采集與處理

1.6.1 樣品采集

灌胃14 d后，頸部脫臼處死小鼠，無(wú)菌條件下，收集回盲部末端6 cm以內(nèi)的盲腸內(nèi)容物，置于干燥滅菌試管中，無(wú)菌取1 g樣品加入9 mL生理鹽水，震蕩至盲腸內(nèi)容物完全分散。

1.6.2 盲腸內(nèi)容物菌液稀釋

每份樣品分別取裝有9 mL生理鹽水的帶塞試管8支，滅菌后放置到室溫待用。取震蕩完全分散的盲腸內(nèi)容物1 mL加入到生理鹽水中，依次10倍稀釋至第8 支，稀釋度為 10－8[17]。

1.6.3 接種

如表2所示，在不同的選擇性培養(yǎng)基上涂布相應(yīng)稀釋度的樣品100 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)3個(gè)平行，按照表3所示培養(yǎng)條件分別進(jìn)行培養(yǎng)。

表2 細(xì)菌接種稀釋度Table 2 Bacterial dilution

表3 腸道主要菌群培養(yǎng)條件Table 3 Culture conditions of main intestinal flora

1.7 菌群培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

使用平板活菌計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，選擇單板單菌落數(shù)在30個(gè)～300個(gè)之間的稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算菌落總數(shù)，結(jié)果以對(duì)數(shù)形式表示[18]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Statistix 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（means±SD），方差分析（ANOVA）使用Tukey模式，各干預(yù)組與對(duì)照組、紊亂自然恢復(fù)組的比較采用單因素方差分析法，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01為差異極顯著，采用Sigmaplot軟件進(jìn)行作圖。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 酶解輔助提取單因素試驗(yàn)

設(shè)定提取溫度（30、35、40、45、50、55 ℃），提取時(shí)間（20、40、60、80、100、120 min），提取 pH 值（4、4.5、5、5.5、6、6.5），復(fù)合酶添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%）（相對(duì)于底物），4個(gè)變量中的3個(gè)保持不變，分別研究單因素指標(biāo)不同對(duì)多糖得率造成的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同因素對(duì)五味子多糖得率的影響Fig.1 Effect of different factors on the yield of polysaccharides

由圖1A可知，溫度對(duì)于多糖得率有一定影響，適當(dāng)升高溫度可以增加多糖得率，這是由于溫度升高提高多糖類(lèi)物質(zhì)的布朗運(yùn)動(dòng)水平，使其加速擴(kuò)散到周?chē)軇┲?，同時(shí)適當(dāng)?shù)臏囟纫部梢栽黾用傅幕钚?，加快了?xì)胞壁的破壞從而促進(jìn)多糖溶出。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，雖然能提高多糖的溶解效率，但酶的活力受到抑制，對(duì)多糖得率也造成了一定損失，為了保證較高的多糖得率，選擇40、45、50℃作為后續(xù)正交試驗(yàn)多糖提取溫度變量。

由圖1B可知隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的得率得到提高，當(dāng)時(shí)間超過(guò)80 min時(shí)，多糖的得率不再顯著變化。這主要是因?yàn)槲逦蹲佣嗵请S著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步溶解入水中，同時(shí)，由于復(fù)合酶的作用，使五味子細(xì)胞壁受到破壞，更多的多糖類(lèi)物質(zhì)逐漸溶出。而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑中多糖濃度越來(lái)越高，濃度差變小減慢了多糖進(jìn)入溶劑的速度，多糖溶解入水中的速度逐漸減緩，而酶解的底物也逐漸消耗殆盡，對(duì)于多糖溶出的促進(jìn)作用越發(fā)不明顯[19]。再延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)于提取率沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用，會(huì)造成時(shí)間和能源的浪費(fèi)。綜合時(shí)間和提取率，選擇60、80、100 min作為后續(xù)正交試驗(yàn)的提取時(shí)間變量。

由圖1C可知，pH值對(duì)于多糖的得率有顯著影響，當(dāng)pH值為5.5時(shí)，多糖得率達(dá)到最佳。表明此pH值條件下的復(fù)合酶活力較高，多糖溶出率也較高。隨著pH值提高或降低，酶活隨之下降，從而影響了多糖得率，這可能與多糖親水基團(tuán)及疏水基團(tuán)的暴露有關(guān)系。因此，選擇5.0、5.5、6.0作為后續(xù)正交試驗(yàn)的提取pH值變量。

由圖1D可知，當(dāng)復(fù)合酶用量達(dá)到提取液質(zhì)量的2.0%時(shí)，多糖得率最高達(dá)到11.8%。隨著復(fù)合酶用量的增加，相同時(shí)間內(nèi)更多的五味子細(xì)胞壁被酶解破壞，造成了多糖的溶出。而當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到一定程度時(shí)，更多的酶制劑對(duì)改善多糖得率的效果微乎其微，這可能是由于復(fù)合酶含量相對(duì)于底物過(guò)高，底物過(guò)早被消耗而造成了酶制劑的浪費(fèi)[20]。為了讓酶解有效率且不過(guò)分浪費(fèi)酶制劑，選擇了1.5%、2.0%、2.5%添加量作為后續(xù)正交試驗(yàn)的復(fù)合酶變量。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

五味子多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)水平表見(jiàn)表4，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，影響酶解輔助提取五味子多糖的主次因素為：提取復(fù)合酶添加量>pH值>酶解時(shí)間>酶解溫度。K值得最適條件為A2B2C1D1，以最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在最佳條件下，五味子多糖提取率為11.5%，沒(méi)有A2B2C3D1條件下獲得的五味子多糖得率高，因此試驗(yàn)選用A2B2C3D1條件，即提取溫度45℃、提取時(shí)間80 min、提取pH 6.0、復(fù)合酶添加量1.5%。

表4 五味子多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)水平表Table 4 Factors and coded levels used in the orthogonal array design for optimization of polysaccharide from Schisandra chinensis extraction

表5 五味子多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design scheme and corresponding results for optimization of polysaccharide from Schisandra chinensis extraction

2.3 五味子多糖的攝入對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.3.1 攝入五味子多糖對(duì)雙歧桿菌的作用

經(jīng)過(guò)超濾、凍干等步驟的操作，最終能夠得到的五味子粉末多糖純度經(jīng)檢測(cè)可達(dá)到92.32%。

分別使用不同劑量的五味子多糖灌胃造模小鼠0、7、14天后，連同空白對(duì)照組和紊亂自然恢復(fù)組，研究不同劑量五味子多糖的攝入對(duì)于小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌含量的影響，如圖2所示。

由圖2可知，五味子多糖有助于提升小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的含量，持續(xù)攝入五味子多糖，小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌逐漸增多，而且隨著多糖攝入量的提高，小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的含量有所提高。雙歧桿菌具有抑制致病菌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境的作用，本研究結(jié)果顯示五味子多糖能夠促進(jìn)益生菌之一——雙歧桿菌的生長(zhǎng)，且促進(jìn)作用與多糖攝入劑量呈正相關(guān)。

圖2 各組小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量Fig.2 The quantity of Bifidodacterium on intestinal flora of mice in each group

2.3.2 攝入五味子多糖對(duì)乳桿菌的作用

分別使用不同劑量的五味子多糖灌胃造模小鼠0、7、14天后，連同空白對(duì)照組和紊亂自然恢復(fù)組，研究不同劑量五味子多糖的攝入對(duì)于小鼠腸道內(nèi)乳桿菌含量的影響，如圖3所示。

圖3 各組小鼠腸道內(nèi)乳桿菌數(shù)量Fig.3 The quantity of Lactobacilus on intestinal flora of mice in each group

由圖3可知，第7天，對(duì)比紊亂自然恢復(fù)組，中劑量組小鼠腸道內(nèi)乳桿菌的數(shù)量有極顯著增加，第14天，高劑量組小鼠腸道內(nèi)乳桿菌的數(shù)量顯著增加，持續(xù)攝入五味子多糖可以提高小鼠腸道內(nèi)乳桿菌的含量，高劑量的五味子多糖長(zhǎng)時(shí)間飼喂能夠顯著提高小鼠腸道中的乳桿菌含量，且促進(jìn)作用與多糖攝入劑量呈正相關(guān)。

2.3.3 攝入五味子多糖對(duì)腸球菌的作用

分別使用不同劑量的五味子多糖灌胃造模小鼠0、7、14天后，連同空白對(duì)照組和紊亂自然恢復(fù)組，研究不同劑量五味子多糖的攝入對(duì)于小鼠腸道內(nèi)腸球菌含量的影響，如圖4所示。

圖4 各組小鼠腸道內(nèi)腸球菌數(shù)量Fig.4 The quantity of Enterococcus on intestinal flora of mice in each group

由圖4可知，灌胃鹽酸林可霉素后，紊亂自然恢復(fù)組小鼠腸道內(nèi)腸球菌數(shù)量極顯著升高，從第7天開(kāi)始，五味子多糖中劑量組小鼠腸道內(nèi)腸球菌數(shù)量顯著降低，第14天時(shí)，低、中、高劑量組小鼠腸道內(nèi)腸球菌數(shù)量均極顯著降低，持續(xù)攝入五味子多糖可以顯著降低小鼠腸道內(nèi)腸球菌的含量，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.3.4 攝入五味子多糖對(duì)大腸桿菌的作用

分別使用不同劑量的五味子多糖灌胃造模小鼠0、7、14天后，連同空白對(duì)照組和紊亂自然恢復(fù)組，研究不同劑量五味子多糖的攝入對(duì)于小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌含量的影響，如圖5所示。

由圖5可知，灌胃鹽酸林可霉素后，小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量顯著升高，喂食五味子多糖后小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量呈下降趨勢(shì)，在第14天時(shí)，中、高劑量五味子多糖組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量分別顯著、極顯著降低，持續(xù)攝入五味子多糖可以顯著降低小鼠腸道內(nèi)腸球菌的含量，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 五味子多糖對(duì)小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重變化見(jiàn)圖6。

圖5 各組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量Fig.5 The quantity of Escherichia on intestinal flora of mice in each group

圖6 實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重變化Fig.6 The body weight of mice in each group during the experiment

由圖6可見(jiàn)，小鼠喂食期間體重的變化可見(jiàn)，同空白組比較，紊亂自然恢復(fù)組小鼠體重極顯著降低，不同劑量五味子多糖對(duì)小鼠體重的影響有差異，其中高劑量組小鼠體重變化與空白組相似，可見(jiàn)，不同劑量五味子多糖在發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群作用的同時(shí)對(duì)小鼠機(jī)體的生長(zhǎng)有一定的影響

3 結(jié)論與討論

健康的人體內(nèi)存在大量微生物，長(zhǎng)期與機(jī)體保持平衡。腸道內(nèi)菌群形成微生態(tài)系統(tǒng)，以保護(hù)機(jī)體免受各種疾病的損傷。當(dāng)人體腸道的菌群紊亂時(shí)，益生菌會(huì)大量減少，有害菌會(huì)大量增殖，破壞腸道環(huán)境。腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌共同保護(hù)機(jī)體免受外界環(huán)節(jié)的干擾，適當(dāng)提高腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量可以更好的為機(jī)體設(shè)立防御系統(tǒng)。

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)可知，酶解輔助提取五味子多糖的最佳條件為提取溫度45℃、提取時(shí)間80 min、提取pH 6.0、復(fù)合酶添加量1.5%，復(fù)合酶添加量對(duì)酶法提取五味子多糖影響最大，多糖提取率達(dá)到11.59%，五味子粉末多糖純度經(jīng)檢測(cè)可達(dá)到92.32%。

與空白對(duì)照組比較，紊亂自然恢復(fù)組內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量均顯著減低，腸球菌、大腸桿菌數(shù)量極顯著增加，表明成功建立了腸道菌群失調(diào)小鼠模型，破壞了小鼠腸道內(nèi)菌群形成的微生態(tài)系統(tǒng)。在此條件下攝入五味子多糖，腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌數(shù)量顯著增高，腸球菌、大腸桿菌等條件性致病菌的數(shù)量顯著降低，且均存在劑量效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)對(duì)小鼠機(jī)體的生長(zhǎng)有一定的影響。表明五味子多糖確實(shí)能夠在一定程度上調(diào)節(jié)因鹽酸林可霉素導(dǎo)致的腸道紊亂，且高劑量的多糖對(duì)以上指標(biāo)的改善效果最好。這可能是由于腸道內(nèi)有益菌利用多糖進(jìn)行代謝后產(chǎn)生了乳酸、乙酸等短鏈脂肪酸，降低了腸道內(nèi)的pH值，從而抑制腸球菌、大腸桿菌的生長(zhǎng)。