蘆筍總皂苷的提取純化及抗氧化研究

葛思琪，趙慶生，孫廣利，趙兵，陳哲，黃云祥，查圣華

（1.北京城市學院，北京100094；2.中國科學院過程工程研究所，北京100090；3.河北省蘆筍產業(yè)技術研究院，河北省蘆筍工程技術研究中心，河北秦皇島066000）

蘆筍（Asparagus officinalis L.），學名石刁柏，別名龍須菜、文山竹。蘆筍為天門冬科天門冬屬多年生宿根草本植物，原產地為歐洲的地中海東岸以及小亞細亞一帶[1]，19世紀末20世紀初傳入我國[2]。蘆筍，性味涼，甘、苦。具有潤肺鎮(zhèn)咳，祛痰殺蟲的功效。據《中藥大辭典》記載，蘆筍的塊根入藥，利尿，可降低腎小管的再吸收[1]。醫(yī)學巨著《本草綱目》把蘆筍列為上品，并對它的藥用價值作了詳細闡述。近幾年來，蘆筍作為藥食兩用的保健型蔬菜，因其眾多的藥用價值與營養(yǎng)價值而廣受歡迎。蘆筍中含大量皂苷、黃酮、多糖等成分，具有抗癌[3-4]、提高機體免疫力[5-6]、降血脂[7-8]、抗衰老[9-10]以及抗疲勞[11-12]、護肝[13-14]、抗?jié)僛15-16]、殺菌鎮(zhèn)痛[17]等作用。李翠霞等測定了蘆筍與其他日常蔬菜的營養(yǎng)成分，并進行對比。結果表明，蘆筍含有較高的營養(yǎng)成分，此外還含有豐富的維生素和礦物質元素，其中Fe、Mg、Zn、Ca 等元素含量較高于其他蔬菜[18]。

蘆筍皂苷是蘆筍中的重要活性成分之一，蘆筍皂苷具有較明顯的抗氧化活性，可以考慮將其開發(fā)成為新型的抗氧化藥劑[19]。但是市場上未見有蘆筍皂苷為主要成分的藥物和保健品在售，其主要原因是皂苷含量達不到要求。本文從蘆筍總皂苷的提取、純化及蘆筍總皂苷的抗氧化活性這3個方面對蘆筍總皂苷做了系統(tǒng)地研究，為進一步研究與開發(fā)利用蘆筍總皂苷提供了線索和依據。

1 試驗材料

1.1 原料

蘆筍：由秦皇島長勝營養(yǎng)健康科技有限公司提供，干燥后用粉碎機粉碎，過10目篩，備用。

1.2 試驗試劑

菝葜皂苷元標準品（純度為95%）：索萊寶科技有限公司；無水乙醇、石油醚、正丁醇：北京化工廠；冰醋酸：北京市通廣精細化工公司；高氯酸：天津市鑫源化工有限公司；香蘭素：國藥集團化學試劑有限公司，以上所以試劑均為分析純。DPPH、ABTS：阿拉丁試劑上海有限公司；抗壞血酸：西隴化工股份有限公司，以上所有試劑均為分析純；HPD-100大孔吸附樹脂：天津南開大學化學工廠。

1.3 試驗儀器

DFT-150粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；VB540 10目標準檢驗篩：上虞縣儀器紗篩廠；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；2802紫外可見分光光度計：尤尼克（上海）儀器有限公司；DF-101S水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠。

2 試驗方法

2.1 總皂苷測定方法

2.1.1 菝葜皂苷元標準曲線的確定

精密稱取菝葜皂苷元5 mg，用甲醇定容至5 mL。分別配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的梯度溶液。精密吸取400 μL不同濃度的菝葜皂苷元標準品，70℃水浴揮干溶劑。配制5%的香草醛-冰醋酸溶液（0.5 g香草醛，用冰醋酸定容至10 mL），加入5%的香草醛-冰醋酸溶液 200 μL，高氯酸 800 μL，70 ℃水浴 15 min，取出后冷卻至室溫。加入5 mL冰醋酸，在400 nm～800 nm下進行全波長掃描，確定最大吸收波長。

2.1.2 總皂苷含量測定

根據上述方法確定的檢測波長進行總皂苷含量測定。提取液皂苷含量測定用移液槍吸取一定體積的提取液，按測定標準曲線的方法測定樣品提取液的吸光值，以不加提取液為空白對照，計算提取液中的蘆筍總皂苷含量。

2.2 提取工藝

將新鮮蘆筍樣品洗凈，切斷，于40℃～60℃電熱鼓風干燥箱中烘干，用粉碎機粉碎并過10目篩，密封保存?zhèn)溆?。稱取一定量的蘆筍粉末，研究不同提取時間、提取溫度、料液比以及乙醇濃度等試驗條件對蘆筍總皂苷提取率的影響。精密稱取一定質量的蘆筍粉末，置于圓底燒瓶中，加入一定濃度的乙醇適量，在一定的水浴條件下進行回流提取，離心過濾。將粗提液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，干燥至恒重。

提取率計算公式如下：提取率/%=蘆筍粗提物中總皂苷重量/蘆筍原料總重量×100

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 乙醇濃度對蘆筍總皂苷提取率的影響

稱取蘆筍粉末，在提取溫度為80℃，料液比1∶40（g/mL）的條件下，分別以 50%、60%、70%、80%和90%的乙醇濃度提取1.5 h，考察不同乙醇濃度對蘆筍總皂苷的提取率的影響。

2.2.1.2 料液比對蘆筍總皂苷提取率的影響

稱取蘆筍粉末，在提取溫度為80℃，乙醇濃度為70%的條件下，分別以 1∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1∶40（g/mL）的料液比（蘆筍粉末質量∶乙醇溶液體積）提取1.5 h，考察不同料液比對蘆筍總皂苷的提取率的影響。

2.2.1.3 提取溫度對蘆筍總皂苷提取率的影響

稱取蘆筍粉末，在料液比為 1∶35（g/mL），乙醇濃度為70%的條件下，分別于60、70、80、90℃和100℃下提取1.5 h，考察不同提取溫度對蘆筍總皂苷的提取率的影響。

2.2.1.4 提取時間對蘆筍總皂苷提取率的影響

稱取蘆筍粉末，在溫度為80℃，料液比為1∶35（g/mL），乙醇濃度為 70%的條件下，分別提取 0.5、1、1.5、2 h和2.5 h，考察不同提取時間對蘆筍總皂苷的提取率的影響。

2.2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）和提取溫度（D）4個因素，每個因素設3個水平，設計L9（34）正交試驗表。對所得試驗結果進行極差分析，確定最佳工藝條件。正交因素水平表見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

2.3 純化工藝

2.3.1 萃取法

依次使用石油醚與水飽和正丁醇萃取4次。

2.3.2 大孔樹脂除雜

2.3.2.1 樹脂的預處理

稱取一定量的HPD-100大孔吸附樹脂，先用無水乙醇充分浸泡，濕法裝柱，用95%乙醇洗脫，至流出液加4倍量的純水沖洗至流出液不變渾濁為止。再用純水洗盡柱內乙醇，作為濕樹脂，備用。

2.3.2.2 乙醇洗脫梯度的選擇

萃取后的提取物溶液緩慢上樣至HPD-100大孔吸附樹脂柱中，依次用4倍柱體積（BV）、體積分數(shù)為0%、20%、50%、80%、95%的乙醇水溶液過柱，收集各洗脫液，分別測定各洗脫液的皂苷含量、固形物含量。

2.3.2.3 洗脫劑用量的確定

萃取后的提取物溶液緩慢上樣至HPD-100大孔吸附樹脂柱中，依次用0%、20%、50%、80%、95%的乙醇洗脫。以1 BV/份收集流份。測定各流份中固形物含量和蘆筍總皂苷的含量。

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH法測定抗氧化活性

DPPH自由基清除能力：配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液（精密稱取2 mg DPPH使用無水乙醇定容至50 mL）。取1 mL不同濃度的各樣品，加入1 mL DPPH乙醇溶液，混勻，在室溫下于暗處靜置30 min，于517 nm處測定吸光值。使用抗壞血酸作為陽性對照。DPPH自由基清除率RDPPH用以下公式計算：

式中：A0為以水代替樣品作為空白對照測得的吸光值；Ai為各樣品測定所得吸光值；Aj為以水代替DPPH乙醇溶液時各樣品所測得的吸光值。

2.4.2 ABTS法測定抗氧化活性

取 50 mL ABTS溶液（7 mmol/L）和 880 μL過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）混合，于室溫下在暗處反應24 h形成ABTS儲備液，使用前用蒸餾水稀釋80倍（至測樣時空白對照在734 nm處的吸光值為0.7±0.02）作為ABTS工作液。樣品用蒸餾水稀釋成不同濃度，取1 mL樣品溶液與4 mL ABTS工作液混合，振蕩30 s，在室溫下于暗處反應6 min后，于734 nm處測定吸光值。使用抗壞血酸作為陽性對照。ABTS+自由基清除率RABTS用如下公式計算：

式中：A0為以水代替樣品溶液測得吸光值，Ai為各樣品溶液測定所得吸光值，Aj為以水代替ABTS溶液時各樣品所測得的吸光值。

2.5 數(shù)據分析方法

研究數(shù)據（3次數(shù)據平均值±標準偏差）采用Excel 2007制圖及SPSS 19.0進行單因素方差分析。

3 結果與分析

3.1 菝葜皂苷元標準曲線的確定

菝葜皂苷元經香草醛-冰醋酸顯色后在400 nm～800 nm范圍內進行全波長掃描，光譜掃描曲線如圖1所示。

圖1 菝葜皂苷元的全波長掃描圖Fig.1 Whole wavelength scan of sarsaparilla saponin determination

由圖1結果發(fā)現(xiàn)在527 nm處有最大吸收峰。

以吸光度為縱坐標，不同濃度（mg/mL）的菝葜皂苷元為橫坐標，繪制標準曲線，如圖2所示。

圖2 蘆筍總皂苷檢測標準曲線Fig.2 Standard curve for total saponins

經回歸分析，得回歸方程為y=1.152x+0.011 9，R2=0.994 6，式中y為吸光度，x為菝葜皂苷元的濃度。表明菝葜皂苷元標準曲線在0.2 mg/mL～1 mg/mL范圍內與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關系，可作為蘆筍總皂苷含量測定的標準曲線。

3.2 各單因素對總皂苷含量的影響

3.2.1 不同提取溫度

不同提取溫度對蘆筍總皂苷的提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度對提取率的影響Fig.3 The effect of the temperature on the yield

由圖3可知，隨著提取溫度的增加，蘆筍總皂苷的提取率變化雖不明顯，但還是可以看出在60℃～80℃時，蘆筍總皂苷的提取率呈現(xiàn)上升趨勢；并在80℃到達最高，之后再80℃～100℃呈現(xiàn)下降趨勢。因此，提取溫度暫定為80℃。由于在70、80、90℃時，蘆筍總皂苷提取率較高且平穩(wěn)，因此正交試驗的3個水平分別設計為 70、80、90℃。

3.2.2 不同提取時間

不同提取時間對蘆筍總皂苷的提取率的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨著提取時間的增加，蘆筍總皂苷的提取率不斷增大，當提取時間達到2 h以后，提取率開始呈現(xiàn)下降的趨勢。由于在1、1.5、2 h時，蘆筍總皂苷提取率較高且平穩(wěn)，因此正交試驗的3個水平分別設計為 1、1.5、2 h。

圖4 提取時間對提取率的影響Fig.4 The effect of the extraction time on the yield

3.2.3 不同乙醇濃度

不同乙醇濃度對蘆筍總粗皂苷的提取率的影響如圖5所示。

圖5 乙醇濃度對提取率的影響Fig.5 The effect of the ethanol concentration on the yield

由圖5可知，當乙醇濃度為50%～60%時，蘆筍總皂苷提取率隨著乙醇濃度的增大而緩慢增大，而當乙醇濃度高于70%時，提取率明顯呈上升趨勢，乙醇濃度為90%時，蘆筍總皂苷的提取率上升到9.3%。由此可以說明，70%、80%、90%時，蘆筍總皂苷提取率呈上升趨勢，并趨于穩(wěn)定，因此正交試驗的3個水平分別設計為70%、80%、90%。

3.2.4 不同料液比

不同料液比對蘆筍總粗皂苷的提取率的影響如圖6所示。

圖6 不同料液比對提取率的影響Fig.6 The effect of the ratio of materialto liquid on the yield

由圖6可知，當料液比為 1∶20（g/mL）～1∶35（g/mL）時，蘆筍總皂苷提取率隨著料液比的增大而逐漸增加，而當料液比大于1∶35（g/mL）時，提取率開始呈下降的趨勢，當料液比增加到1∶40（g/mL）時，蘆筍總皂苷的提取率逐步下降到7.65%。由此可以說明，料液比為1∶35（g/mL）時，最有利于蘆筍總皂苷的提取。因此正交試驗的 3 個水平分別設計為 1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）。

3.3 正交試驗結果

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test

由極差分析可知，各因素對蘆筍總皂苷提取率的影響順序為：乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時間，因為 A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C1＞C3＞C2，D2＞D1＞D3，所以最優(yōu)組合為A3B3C1D2，即：乙醇濃度為90%，提取溫度為80℃，料液比為 1 ∶40（g/mL），提取時間為 1 h。經驗證，在該條件下蘆筍總皂苷提取率為10.68%，與正交試驗的結果相近。

3.4 純化工藝的確定

3.4.1 萃取純化蘆筍總皂苷

采用石油醚和水飽和正丁醇萃取后，根據3.1中回歸方程公式計算所得，蘆筍總皂苷的含量達到44.8%，極大地提高了蘆筍總皂苷的純度。

3.4.2 大孔樹脂各級分總皂苷含量、固形物含量

采用大孔吸附樹脂進行純化蘆筍總皂苷，分別收集不同流分的固形物，并對其中所含的蘆筍總皂苷進行檢測與對比。

由表3可知，在用4 BV的蒸餾水洗脫時，已經能將萃取物中的水溶性雜質除盡，再繼續(xù)用蒸餾水洗脫，則沒有物質被洗脫下來；20%乙醇洗脫用量至3BV時，在流份中總皂苷含量明顯呈減少狀態(tài)，當用量達到4 BV時，開始有皂苷增加，說明皂苷隨著20%乙醇用量的增加，已有部分被解吸，因此，20%乙醇的用量確定為3 BV；當50%乙醇洗脫時，第1 BV檢測出大量蘆筍總皂苷，并依此呈減弱，當50%乙醇的用量為4 BV時，已經能夠洗下大部分皂苷；當80%乙醇洗脫時，4個流分均有少量皂苷析出，可以認為蘆筍總皂苷已被完全洗下；95%乙醇洗脫流份中幾乎不含皂苷。根據3.1中回歸方程計算所得，各部分蘆筍總皂苷的含量分別為16.0%、11.1%、44.3%、32.5%、0% ，當乙醇濃度為50%的第3個流分時，總皂苷含量最高為51.0%。

表3 不同洗脫劑用量對蘆筍總皂苷洗脫的影響Table 3 Effects of different dosage of eluting agent on elution of saponins from asparagus

3.5 蘆筍總皂苷純化前后抗氧化活性的測定

蘆筍總皂苷對DPPH自由基清除能力試驗結果見圖7。

圖7 總皂苷對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Scavenging effect of saponins on DPPH radicals

圖7 試驗結果表明，在0～1 000 μg/mL范圍內，各樣品清除DPPH自由基的效果隨濃度的增加而增加。在相同濃度下，隨著蘆筍總皂苷含量的提高，其清除DPPH自由基能力提高。計算后所得純化前、純化后和抗壞血酸的 IC50分別為 147.43、140.05、12.16 μg/mL。

蘆筍總皂苷對ABTS+自由基清除能力見圖8。

圖8 總皂苷對ABTS+自由基清除率的影響Fig.8 Scavenging effect of saponins on ABTS radicals

圖8 試驗結果與DPPH自由基清除能力具有相同的趨勢，純化前后的蘆筍總皂苷均具有較強的ABTS+自由基清除能力。計算所得純化前、純化后和抗壞血酸的 IC50分別為 212.76、169.70、10.61 μg/mL。蘆筍總皂苷的抗氧化活性為其在開發(fā)抗氧化、抗衰老產品領域提供了理論基礎。

4 結論

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗設計對蘆筍總皂苷提取工藝進行優(yōu)化。研究結果表明乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度對總皂苷提取率的影響不是簡單的線性關系。本試驗確定了回流提取法提取蘆筍總皂苷的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度為90%，料液比為 1∶40（g/mL），提取溫度為 80℃，提取時間為1 h，蘆筍總皂苷提取率為10.68%。試驗過程中發(fā)現(xiàn)原料均勻度和粉碎度對總皂苷提取率有很大影響，原料粉末越細越均勻，提取率越高；但原料粉末過細會造成溶液過濾困難。提取溫度過高、溶劑加入量過大、提取時間過長都會導致提取率降低，分析其原因可能與雜質的溶出、溶劑的揮發(fā)、某些物質的水解有關，有待于進一步的研究。

通過石油醚脫脂處理，水飽和正丁醇萃取、HPD-100大孔樹脂吸附對蘆筍總皂苷進行純化。采用水飽和正丁醇萃取后，蘆筍總皂苷的含量達到44.8%，極大地提高了蘆筍總皂苷的純度。確定了HPD-100大孔吸附樹脂純化蘆筍總皂苷的最佳純化工藝：上樣量濃度為5 mg/mL，洗脫流速為2 mL/min，分別使用0%、20%、50%、80%、95%的乙醇進行梯度洗脫。結果表明，各部分蘆筍總皂苷的含量分別為16.0%、11.1%、44.3%、32.5%、0%，當乙醇濃度為50%的第3個流分時，總皂苷含量最高為51.0%，為純化前的4.78倍。對比研究純化前后蘆筍總皂苷對自由基的清除能力。研究發(fā)現(xiàn)，隨著蘆筍皂苷含量的提高，體外抗氧化活性增大。清除DPPH自由基效果較好，其IC50分別為147.43、140.05 μg/mL；對 ABTS+自由基的 IC50分別為212.76、169.70 μg/mL。