張小華,操慶國(guó),郭欽
(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江212400;2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江212013)
面制品是一種有著悠久歷史的傳統(tǒng)食品,制作的工藝多,產(chǎn)品種類也較多。在面制品制作為成品的同時(shí),腐敗變質(zhì)問(wèn)題一直困擾左右,而腐敗變質(zhì)問(wèn)題主要由微生物引起的[1]。直至防腐劑的出現(xiàn),一定程度上解決了面制品腐敗的問(wèn)題,延長(zhǎng)了貯藏時(shí)間。一般添加到食品的防腐劑種類很多,偶爾食用問(wèn)題不大,但是長(zhǎng)期食用也會(huì)在體內(nèi)富集從而影響人體健康[2],特別是人們?nèi)粘I钪惺秤昧枯^大的面制品,因此國(guó)標(biāo)GB2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》也對(duì)面制品中防腐劑使用量有明確限制[3]。
隨著現(xiàn)代人們生活水平的提高,對(duì)食品安全的標(biāo)準(zhǔn)和要求也在提高,發(fā)現(xiàn)并使用更安全更高效的防腐劑一直在不斷的研究中。新型的食用防腐劑一般分為化學(xué)制劑的和生物制劑兩大類,化學(xué)類的有丙酸鈣、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、乳酸鈉和富馬酸等[4-8],生物類的有聚賴氨酸、納他霉素和乳酸鏈球菌素等[9-13]。本試驗(yàn)從腐敗的面制品中分離出5種共11株霉菌[14-16](包括2株青霉菌、2株黃曲霉菌、3株絲孢酵母菌、1株黑根霉菌、3株黑曲霉菌),針對(duì)這些不同菌種以及同種不同株之間的差異,研究以上幾種新型防腐劑對(duì)其抑菌效果,旨在為面制品新型防腐技術(shù)的使用提供參考。
富馬酸、乳酸鈉、丙酸鈣、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、納他霉素、聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素:中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。2株青霉菌、2株黃曲霉菌、3株絲孢酵母菌、1株黑根霉菌、3株黑曲霉菌:分離自不同來(lái)源腐敗變質(zhì)的面制品??販?fù)u床培養(yǎng)箱(AG3000):無(wú)錫市AIBOER科技技有限公司;臺(tái)式培養(yǎng)箱(RT151):杭州長(zhǎng)城儀器設(shè)備有限公司。
1.2.1 培養(yǎng)基的制備
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基的配制:按照培養(yǎng)基所要求的比例,加熱沸騰至完全溶解,分裝后高壓滅菌備用。
察氏液體培養(yǎng)基的配制:參照GB4789.28-84《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》進(jìn)行配制[17]。
1.2.2 菌懸液的制備
將5種共11株霉菌32℃條件下分別在PDA斜面培養(yǎng)基上活化24 h,之后霉菌菌種再分別接種于察氏液體培養(yǎng)基中,在28℃下震蕩培養(yǎng)36 h,菌液的濃度約為107CFU/mL。
1.2.3 抑菌活性的測(cè)定
以培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基為基質(zhì),分別添加含不同濃度防腐劑作為試驗(yàn)對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組用無(wú)菌水取代防腐劑[18-22]?;旌隙ㄈ莺髮⑴囵B(yǎng)液各取0.1 mL涂平板,32℃條件下培養(yǎng)24 h,計(jì)數(shù)并以此計(jì)算各種防腐劑的抑菌率。
1.2.4 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測(cè)定
根據(jù)不同濃度防腐劑對(duì)霉菌的抑菌效果,初步確定MIC的范圍。再在此范圍內(nèi)配制不同濃度的防腐劑溶液測(cè)定其抑菌率,抑菌率為100%的濃度即為最低抑菌濃度[23-24]。
分別配制0.1、1.0、10 mg/mL等3個(gè)梯度濃度的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率,考察對(duì)青霉菌、黃曲霉菌、絲孢酵母菌、黑根霉菌和黑曲霉菌的抑菌效果,同種不同株之間的抑菌效果以平均抑菌效果計(jì),結(jié)果見(jiàn)圖1~圖3。
圖1 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)各種菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against different species of mould
圖2 濃度為1 mg/mL的防腐劑對(duì)各種菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 1 mg/mL against different species of mould
圖3 濃度為10 mg/mL的防腐劑對(duì)各種菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 10 mg/mL against different species of mould
由圖1~圖3可知,納他霉素和聚賴氨酸對(duì)青霉菌、黃曲霉菌、絲孢酵母菌和黑根霉菌抑菌效果較好,0.1 mg/mL的納他霉素和聚賴氨酸基本能達(dá)到對(duì)4種霉菌100%的抑菌效果,但是對(duì)黑曲霉菌的抑菌效果不明顯,10 mg/mL的納他霉素才能達(dá)到75%的抑菌效果,以及10 mg/mL的聚賴氨酸才能達(dá)到98%的抑菌效果;而1 mg/mL的乳酸鏈球菌素對(duì)5種霉菌能達(dá)到100%的抑菌率;富馬酸的整體的抑菌效果最不理想,0.1 mg/mL濃度對(duì)絲孢酵母菌、黑根霉菌和黑曲霉菌的抑菌率為0,10 mg/mL濃度也只能對(duì)絲孢酵母菌達(dá)到100%的抑菌率。
2.2.1 青霉菌株之間抑菌效果的比較
分別配制濃度為0.1 mg/mL的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率,考察對(duì)青霉菌不同菌株之間的抑菌效果,結(jié)果見(jiàn)圖4。
由圖4可知,0.1 mg/mL濃度的納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸溶液對(duì)青霉菌株的抑菌效果較好,基本能達(dá)到100%,且對(duì)青霉菌1和青霉菌2的抑菌效果差異不大;乳酸鈉對(duì)青霉菌1和青霉菌2的抑菌效果有差異,兩者之間相差達(dá)到30%;富馬酸對(duì)青霉菌的抑菌效果最差,抑菌效果只能達(dá)到20%。
2.2.2 黃曲霉菌株之間抑菌效果的比較
分別配制濃度為0.1 mg/mL的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率,考察對(duì)黃曲霉菌不同菌株之間的抑菌效果,結(jié)果見(jiàn)圖5。
由圖5可知,0.1 mg/mL濃度的納他霉素、乳酸鏈球菌素、聚賴氨酸溶液對(duì)2種黃曲霉菌株的抑菌效果都很好,抑菌率能達(dá)到100%;對(duì)羥基苯甲酸丙酯對(duì)黃曲霉菌1和黃曲霉菌2的抑菌效果有明顯差異,兩者之間相差達(dá)到90%;富馬酸和乳酸鈉對(duì)黃曲霉菌株的抑菌效果最差,且菌株之間的抑菌效果差不多。
圖4 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)不同株青霉菌的抑菌效果Fig.4 Bacteriostatic effect of 0.1 mg/mL preservative on different strains of Penicillium
圖5 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)不同株黃曲霉菌的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effect of preservatives of 0.1 mg/mL on different strains of Aspergillus flavus
2.2.3 絲孢酵母菌株之間抑菌效果的比較
分別配制濃度為0.1 mg/mL的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率,考察對(duì)絲孢酵母菌3種不同菌株之間的抑菌效果,結(jié)果見(jiàn)圖6。
圖6 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)不同株絲孢酵母菌的抑菌效果Fig.6 Bacteriostatic effect of preservatives of 0.1 mg/mL on different strains of trichosporon
由圖6可知,0.1 mg/mL濃度的納他霉素和聚賴氨酸對(duì)3種絲孢酵母菌株的抑菌效果都較好,抑菌率都能達(dá)到95%以上;而乳酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和丙酸鈣對(duì)3種絲孢酵母菌株的抑菌效果存在明顯差異;富馬酸對(duì)3種絲孢酵母菌株的抑菌效果不佳,且不同菌株之間的抑菌率差異明顯。
2.2.4 黑曲霉菌株之間抑菌效果的比較
分別配制濃度為0.1 mg/mL的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率,考察對(duì)黑曲霉菌3種不同株之間的抑菌效果,結(jié)果見(jiàn)圖7。
圖7 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)不同株黑曲霉菌的抑菌效果Fig.7 Bacteriostatic effect of preservatives of 0.1 mg/mL on different strains of Aspergillus niger
由圖7可知,只有對(duì)羥基苯甲酸丙酯對(duì)黑曲霉菌3的抑菌率達(dá)到100%;納他霉素、乳酸鏈球菌素、聚賴氨酸以及丙酸鈣對(duì)3株黑曲霉菌的抑菌率效果差異較大;富馬酸和乳酸鈉基本對(duì)黑曲霉菌沒(méi)有抑菌效果。
7種食品防腐劑最低抑菌濃度的分析見(jiàn)表1。
表1 7種食品防腐劑對(duì)霉菌的MIC值Table 1 MICs of seven food preservatives against different species of mould mg/mL
由表1可知,納他霉素對(duì)11株霉菌都有很強(qiáng)的抑菌效果,在7種防腐劑中,它的最低抑菌濃度都是最小的;而富馬酸對(duì)各株菌的最小抑菌濃度明顯高于其他防腐劑,其抑菌效果在7種防腐劑中是最差的。
7種防腐劑最低抑菌濃度綜合排序?yàn)椋杭{他霉素<乳酸鏈球菌素<聚賴氨酸<對(duì)羥基苯甲酸丙酯<丙酸鈣<乳酸鈉<富馬酸。
本試驗(yàn)開(kāi)展了7種新型食品防腐劑對(duì)面制品中腐敗霉菌抑菌效果的比較研究試驗(yàn)。結(jié)果表明7種防腐劑對(duì)5種共11株霉菌都有不同程度的抑菌效果,含防腐劑溶液濃度越高其抑菌效果越好??傮w來(lái)看,7種食品防腐劑抑菌效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋杭{他霉素>乳酸鏈球菌素>聚賴氨酸>對(duì)羥基苯甲酸丙酯>丙酸鈣>乳酸鈉>富馬酸。同一種防腐劑對(duì)于同種不同株的霉菌,其抑菌效果也不盡相同,甚至相差很大。因此,對(duì)于防腐劑的抑菌效果,不能單純以菌種來(lái)定論,應(yīng)具體到所涉及的每一株菌[25]。從抑菌效果排序可以看出,前三名都是生物類防腐劑,試驗(yàn)也進(jìn)一步證明了生物類防腐劑比化學(xué)類防腐劑更為高效、廣譜,因此,天然、安全的生物類防腐劑將是未來(lái)食品防腐領(lǐng)域的重點(diǎn)。