超聲耦合亞臨界水提取螺旋藻粗蛋白及其抗氧化活性研究

胡雙飛，張學(xué)武，范曉丹

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

螺旋藻，亦稱“節(jié)旋藻”藍(lán)藻門屬、段殖藻目、顫藻科的低等原核生物，主要有兩個品鈍頂節(jié)螺旋藻（Spirulinaplatensis,S. platensis）和極大節(jié)螺旋藻（Spirulina mexima, axima）[1]。螺旋藻可食用，蛋白含量豐富高達(dá)60%～80%，營養(yǎng)豐富，且商業(yè)化的螺旋藻蛋白消化率＞80%。因此，螺旋藻蛋白是優(yōu)質(zhì)生物活性肽的良好來源[2,3]。近年來，各種具有生理活性的海藻生物活性多肽的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開辟了廣闊前景，螺旋藻蛋白水解物和多肽的多種功能特性被廣泛研究，例如：降血壓[4]抗炎活性[5]、鐵螯合作用[6]和抗氧化[7]等作用。

傳統(tǒng)的海藻蛋白質(zhì)提取方法處理量小、能耗高、甚至引起蛋白質(zhì)的變性[8]。由此可見，制備海藻活性多肽的首要問題是如何高效獲得具有生物活性功能的海藻粗蛋白質(zhì)，因此，建立簡單高效安全的蛋白提取方法是目前的研究熱點。

亞臨界水，又稱高壓熱水、超熱水或熱液態(tài)水，是指在一定壓力下(一般在 5～20 MPa)，溫度處于100 ℃以上，臨界溫度374 ℃以下的液態(tài)高溫水，其介電常數(shù)ε由70減小至1，即其性質(zhì)由強極性漸變?yōu)榉菢O性，依據(jù)有機物相似相溶的原理可將溶質(zhì)按極性由高到低提取出來。根據(jù)文獻報道，利用亞臨界水提取天然產(chǎn)物中的粗蛋白，可有效簡化工藝過程、節(jié)約制備成本[9]，且獲得的蛋白生物活性較高，不足之處為提取率較低，而將亞臨界水與其它方法耦合的研究鮮有報道。鑒于此，本文利用楊日福等[10]設(shè)計的亞臨界水提取設(shè)備如圖1所示，通過在提取釜添加超聲探頭將超聲與亞臨界水耦合，利用該設(shè)備直接提取螺旋藻活性蛋白，為海藻蛋白的提取開創(chuàng)一種高效、低耗、環(huán)保的新技術(shù)。

圖1 亞臨界水設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Subcritical water equipment structure diagram

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：螺旋藻粉購于廣西生巴達(dá)生物科技有限公司。試劑：DPPH：Sigma-Aldrich；ABTS：Sigma-Aldrich；Vc（抗壞血酸）：Sigma-Aldrich；其他所用試劑均為國內(nèi)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器：超聲波破碎儀(Scientz-IID)，寧波新芝；高速冷凍離心機(5415R)，德國Eppendorf公司；超純水儀(Milli-QMillipore)，美國Millipore公司、上海天美科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計 UV1800；SpectraMax? i3x連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器上海有限公司。

設(shè)備：自制亞臨界水提取設(shè)備[8]。

1.3 實驗方法

1.3.1 螺旋藻粗蛋白的制備

1.3.1.1 反復(fù)凍融與超聲均質(zhì)聯(lián)用法[11]

基于反復(fù)凍融與超聲均質(zhì)聯(lián)用是實驗室常用的方法，故后續(xù)稱之為傳統(tǒng)的提取方法。準(zhǔn)確稱取50 g螺旋藻粉，按料液比為1：20加入超純水，磁力攪拌30 min使其充分混溶后，放置于-20 ℃的冰箱中冷凍4 h；冷凍結(jié)束后，置于37 ℃水浴鍋中解凍；反復(fù)凍融操作三次，采用均質(zhì)2 min；均質(zhì)結(jié)束后，以570 W的功率超聲20 min；均質(zhì)和超聲的全過程中，樣品均置于冰浴中；超聲結(jié)束后，將藻液置于4 ℃、10000 r/min條件下離心，取上清液，分裝冷凍，并將凍好的冰塊冷凍真空干燥后，得到螺旋藻粗蛋白，注意全程避光操作。

1.3.1.2 超聲耦合亞臨界水設(shè)備提取法

（1）對亞臨界水提取設(shè)備的改進

亞臨界水提取設(shè)備提取的對象多為固體原料，由于固態(tài)基質(zhì)本身屬性及亞臨界水高溫、高壓特殊條件的要求和限制，本實驗室的亞臨界水提取設(shè)備在提取釜中無法實現(xiàn)安裝攪拌裝置，物料大多是堆積在一起，導(dǎo)致傳質(zhì)效率低和提取過程的不均勻性，并且隨裝料量的增多和增加的堆積高度，這種缺陷表現(xiàn)的異常明顯[12]。鑒于此，本文設(shè)計了亞臨界水物料袋來增大物料與亞臨界水接觸進而提高活性物質(zhì)得率，該物料袋制作方便，在提取釜中剖面結(jié)構(gòu)如2～5圖所示，用于直接增大物料與提取液接觸面積，操作方便，有利于提高天然產(chǎn)物的提取率。后續(xù)實驗采用改進后的物料袋來提取螺旋藻粗蛋白。

圖2 改進前后的提取釜結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The structure diagram of extraction kettle before and after improvement

（2）超聲耦合亞臨界水提取法

將事先準(zhǔn)備好的螺旋藻粉均勻鋪開在6層的支架箍的紗布層中，置于提取釜中，檢查并啟動設(shè)備控制去離子水以 100 mL/min的流速注入預(yù)熱爐預(yù)熱至80～100 ℃，通過預(yù)熱爐注入到提取釜中；提取參數(shù)為：在提取溫度100～160 ℃、提取壓力1～20 MPa、超聲功率50～300 W或不加超聲的條件下，對原料進行有效成分的提取，提取時間為7.5～120 min；對原料進行有效成分的提取，當(dāng)設(shè)備達(dá)到設(shè)定條件時開始計時；收集提取液。后續(xù)操作與水提相同，實驗平行三次。

1.3.2 蛋白含量的測定

以GB/T 5009.5-2003為標(biāo)準(zhǔn)，采用凱氏定氮法測定螺旋藻粉中的蛋白含量。采用 BCA試劑盒測定提取物中的蛋白含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，通過BCA試劑盒測定粗提物中蛋白含量。由各標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出粗提物中的蛋白含量。

將亞臨界水提取得到的活性物質(zhì)在分光光度計上做全波段掃描并與水提的螺旋藻作對比，主要吸收峰都在210～220 nm之間。說明提取出來的物質(zhì)主要為蛋白液。采用 BCA試劑盒測定螺旋藻提取液中的蛋白含量，比較四種提取方法提取的蛋白質(zhì)含量，計算方法見公式1、公式2。

1.3.3 抗氧化活性實驗1.3.3.1 ABTS自由基清除活性測定[13]

ABTS使用液由 7 mM ABTS溶液和 2.45 mM K2S2O8溶液按照1：1的體積比充分混溶，避光反應(yīng)12 h后生成，該溶液提前1 d制備，并且必須當(dāng)天使用。使用前用PBS稀釋到吸光值在732 nm處為0.70±0.02。選取96孔板測定ABTS自由基的清除率，每孔加入20 μL樣品+180 μL ABTS溶液，避光反應(yīng)30 min，于734 nm波長下檢測樣品吸光度值A(chǔ)樣品，以相同的體積的樣品代替樣品提取液作為對照，其吸光值為A對照，空白孔以水代替樣品，用A空白表示，以Vc為對照。ABTS自由基抑制率計算公式如下：

抑制率%=(1-(A樣品-A對照)/A空白)×100%

注：A樣品：樣品+ABTS；A對照：樣品+水；A空白：水+ABTS。

1.3.3.2 DPPH自由基清除活性測定[14]

根據(jù)本實驗室建立好的方法進行活性評價，配制200 μmol/L的DPPH溶液。采用96孔板測定樣品的DPPH自由基清除活性。在提前規(guī)劃好的96孔板內(nèi)，精確移取20 μL樣品+180 μL DPPH溶液，室溫下將二者混合均勻，避光放置30 min，在517 nm處測定其吸光值，用A樣品表示，空白孔以無水乙醇代替樣品溶液，對照組以無水乙醇代替DPPH溶液，其吸光值分別用A對照和A空白表示。以傳統(tǒng)方法提取的螺旋藻粗蛋白與Vc做陽性對照，每個濃度重復(fù)實驗3次，取平均值。

DPPH 自由基清除率%=(1-(A樣品-A對照)/A空白)×100%

注：A樣品：樣品+DPPH；A對照：樣品+乙醇；A空白：水+DPPH。

1.3.3.3 羥基自由基清除能力[15]

配置濃度為1.50 mM的硫酸亞鐵，6.70 mM的雙氧水與1.50 mM的水楊酸鈉溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將配置好的溶液按照10：3：7的比例混勻得混合液，避光保存。采用96孔板測定樣品的羥基自由基清除率，加入20 μL樣品+180 μL的混合液，在37 ℃條件下培養(yǎng)1 h。在562 nm處測吸光度。傳統(tǒng)方法提取的螺旋藻粗蛋白與抗壞血酸做陽性對照。

抑制率%=(1-(A樣品-A對照)/A空白)×100%

注：A樣品：樣品+混合液；A對照：樣品+水；A空白：水+混合液。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理及繪圖采用origin 9.0，采用DPS軟件進行統(tǒng)計軟件方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻中總蛋白含量的測定

經(jīng)計算凱氏定氮法測得的螺旋藻粉中的蛋白含量為75.05%。

2.2 螺旋藻的提取率

2.2.1 傳統(tǒng)方法蛋白提取率的測定

經(jīng)計算采用傳統(tǒng)方法獲得的蛋白提取率為45.76%。

2.2.2 改進前后亞臨界水設(shè)備蛋白提取率的研究

對比改進前后的亞臨界水設(shè)備獲得蛋白的提取率，經(jīng)計算得表1。

表1 四種提取方法提取的蛋白含量Table 1 Four extraction methods to extract the protein content

由表1可知：利用亞臨界水提取設(shè)備提取海藻粗蛋白，在未改進設(shè)備且未超聲處理的情況下提取率僅為10.30%，當(dāng)增大了物料與亞臨界水的接觸面積，在未超聲處理的情況下蛋白得率達(dá)到40.20%，近乎是未改進裝置前的4倍；同樣，未改進設(shè)備在設(shè)備加超聲的情況下，粗蛋白得率為41.30%，但在改進設(shè)備并超聲的情況下，蛋白得率為67.12%，增加近1.60倍。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)增大物料與亞臨界水的接觸面積能讓物料與亞臨界水反應(yīng)更加充分并顯著提高蛋白得率。因此，后續(xù)操作采用改進后的設(shè)備提取螺旋藻粗蛋白。

2.2.3 不同提取時間下蛋白提取率的研究

圖3 不同提取時間下蛋白提取率的研究Fig.3 The extraction rate of protein at different extraction time

由圖3可知，隨著提取時間的增加，蛋白質(zhì)提取率顯著增加，當(dāng)提取時間達(dá)到60 min時提取率趨于穩(wěn)定，達(dá)到30.51%。通過單因素實驗的方差分析，顯著水平α=0.01，故時間對螺旋藻粗蛋白提取率的影響極其顯著當(dāng)提取時間一定亞臨界水與螺旋藻充分接觸在60 min時已提取充分，在提取溫度超過60 ℃時，延長提取時間并沒有顯著提高提取率。據(jù)文獻報道，采用亞臨界水從藥用植物中提取大量有機化合物在40～60 min能獲得較好的提取率[16～19]，與我們的實驗結(jié)果相符。而本實驗室采用傳統(tǒng)方法提取螺旋藻蛋白至少需要16 h才能達(dá)到45.76%。因此，該方法有效縮短了提取時間。

2.2.4 不同超聲功率下蛋白的提取率

圖4 不同超聲功率下蛋白的提取率Fig.4 The extraction rate of protein under different ultrasonic power

由圖4可知，超聲功率由50 W增加至300 W，亞臨界水的提取率先增加后減小，當(dāng)超聲功率達(dá)到200 W時，提取率最高，達(dá)到67.18%。該方法獲得的提取率比未加超聲時提高 25.88%，比傳統(tǒng)方法提高21.42%。通過單因素實驗的方差分析得，顯著水平α=0.01，經(jīng)統(tǒng)計推斷p＜0.01，故超聲功率對提取率的影響極其顯著。超聲波在傳播時可在物質(zhì)介質(zhì)中形成介質(zhì)粒子的機械振動，這種含有能量的超聲振動引起的與媒質(zhì)的相互作用，可以歸納為熱作用、機械振動和空化作用[20]，在一定范圍內(nèi)，超聲頻率越低，空化作用越強，對細(xì)胞損傷越強。因此，在適當(dāng)?shù)某暪β史秶鷥?nèi)，該方法有效增加了提取率。

2.2.5 不同提取溫度下蛋白的提取率

圖5 不同提取溫度下蛋白的提取率Fig.5 The extraction rate of protein under different extraction temperature

由圖5可知，隨著溫度的上升，提取率逐漸上升，當(dāng)溫度達(dá)到150 ℃時，提取率趨于穩(wěn)定在60%左右，通過單因素實驗的方差分析得，當(dāng)溫度從 110 ℃到130 ℃時，提取率沒有顯著變化，大于130 ℃時提取率急速上升，顯著水平α=0.01，經(jīng)統(tǒng)計推斷p＜0.01，故溫度對提取率的影響極其顯著。據(jù)文獻報道，對于植物和藥用植物中的活性或標(biāo)定化合物，亞臨界水使用的提取溫度對提取效率影響很大[18,21,22～27]，Richter等從物理化學(xué)原理角度認(rèn)為，溫度越高，溶質(zhì)的溶解度增加，同時擴散速率也提高，提高了溶劑分離溶質(zhì)-基質(zhì)的相互作用[17]。此外，水的表面張力和粘度隨著溫度的升高而減小，導(dǎo)致樣品易于濕潤并易于滲透[17]。通過對水溫的控制，可以選擇性的提取無機或有機物質(zhì)、極性或非極性有機物質(zhì)。因而，可以通過調(diào)節(jié)溫度提取不同種類的活性成分。

2.2.6 不同提取壓力下蛋白的提取率

圖6 不同提取壓力下蛋白的提取率Fig.6 The extraction rate of protein under different extraction pressure

由圖6可知，隨著壓力的增加，提取率先增大后趨于穩(wěn)定。通過單因素實驗的方差分析得，顯著水平α=0.01，經(jīng)統(tǒng)計推斷p＜0.01，故壓力對提取率的影響極其顯著。當(dāng)壓力達(dá)到10 MPa時，繼續(xù)升高壓力提取率沒有顯著性變化，文獻顯示當(dāng)將水的壓力從0.10 MPa升高到10 MPa時，ε值僅提高0.37[28,29]，可見壓力對水作為提取劑影響較小。提高壓力是為了提高水的沸點避免水汽化影響提取率，改變壓力對從中草藥植物中提取生物活性物質(zhì)得率沒有任何影響[28]。

2.2.7 正交優(yōu)化螺旋藻粗蛋白的提取

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過 L9(34)正交試驗考察溫度、超聲功率、時間、壓力對螺旋藻粗蛋白的提取率的影響正交實驗水平因素表如表2所示。

表2 正交試驗設(shè)計表（4因素3水平）Table 2 Orthogonal experimental design with 4 factor and 3 levels

由表3可知，各因素對指標(biāo)影響的主次為：溫度＞超聲功率＞提取時間＞壓力，最佳條件為A2B2C3D2，即提取溫度150 ℃、超聲功率200 W、提取時間80 min、壓力10 MPa。通過極差分析可以看出，第四列的極差顯著低于其他列，因此可以將此列看做誤差列進行其他因素的顯著性檢驗。由表4可知，通過方差分析，提取溫度和超聲功率對提取率的影響都特別顯著，提取壓力和提取時間不顯著。經(jīng)驗證實驗得，最佳條件下提取的粗蛋白的提取率為74.32%。

表3 正交實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment design and results

k2 67.7 58.18 53.77 54.07 k3 56.66 56.62 54.41 53.67極差R 30.32 11.25 0.86 0.40較優(yōu)水平 A2 B2 C3 D2

表4 正交試驗結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test results

2.3 抗氧化活性

將采用超聲耦合亞臨界水從螺旋藻中提取的粗蛋白與常用的傳統(tǒng)水提方法得到的粗蛋白做抗氧化活性對比，選用的物質(zhì)濃度梯度為0.15～10 mg/mL，對其DPPH、ABTS自由基清除活性以及羥基自由基清除能力進行評價。

2.3.1 ABTS自由基清除活性

圖7 螺旋藻粗蛋白的ABTS自由基清除能力Fig.7 Scavenging effects on ABTS radicals of Spirulina crude protein

由圖7可知，粗蛋白在ABTS的自由基清除中，兩種方法提取出來的粗蛋白自由基清除率低于Vc的自由基清除率，且在0.15～2.50 mg/mL的濃度范圍內(nèi)呈計量依賴性上升。當(dāng)樣品濃度為2.5 mg/mL時，粗蛋白對ABTS自由基清除率均大于95%，繼續(xù)增加樣品濃度，其ABTS自由基清除率無明顯變化。通過超聲耦合亞臨界水在120 ℃、130 ℃、140 ℃、150 ℃下獲得的粗蛋白自由基清除率明顯大于傳統(tǒng)方法提取的粗蛋白的自由基清除率，且超聲耦合亞臨界水獲得的粗蛋白在不同的溫度下，隨著提取溫度的上升，ABTS的自由基清除率逐漸增大。

2.3.2 DPPH自由基清除活性

圖8 螺旋藻粗蛋白的DPPH自由基清除能力Fig.8 Scavenging effects on DPPH radicals of Spirulina crude protein

由圖8可知，兩種方法提取出來的粗蛋白的抗氧化活性低于Vc的抗氧化活性，但對DPPH自由基有一定的清除作用。當(dāng)樣品濃度從 0.15 mg/mL到 10 mg/mL時，傳統(tǒng)水提取方法提出的粗蛋白的DPPH自由基清除率明顯大于超聲耦合亞臨界水提取的粗蛋白的自由基清除率；而超聲耦合亞臨界水提取的粗蛋白隨著提取條件中溫度的升高，抗氧化活性明顯增強，140 ℃、150 ℃亞臨界水條件下提取的粗蛋白對DPPH自由基清除率明顯高于傳統(tǒng)水提取方法提取的粗蛋白。

2.3.3 羥基自由基清除活性

如圖9所示，雖然兩種方法獲得的粗蛋白的羥基自由基清除率雖然低于Vc的抗氧化活性，但對羥基自由基有一定的清除作用。當(dāng)樣品濃度從0.15 mg/mL到10 mg/mL時，粗蛋白的清除率先增加后減小或趨于穩(wěn)定，但是超聲耦合亞臨界水提取的螺旋藻粗蛋白的羥基自由基清除能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法獲得的粗蛋白。

圖9 螺旋藻粗蛋白的羥基自由基清除能力Fig.9 Scavenging effects on hydroxyl radicals of Spirulina crude protein

3 結(jié)論

3.1 本研究采用改造后的亞臨界水提取設(shè)備，以提取率為指標(biāo)，通過單因素與正交試驗得到提取蛋白的最優(yōu)工藝條件：溫度150 ℃、超聲功率200 W、提取時間80 min、壓力10 MPa，在此條件下蛋白的提取率為74.32%。采用ABTS、DPPH、OH自由基清除率法評價不同溫度下提取的螺旋藻粗蛋白的抗氧化能力，結(jié)果顯示，通過超聲耦合亞臨界水提取獲得的粗蛋白在0.15～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)均具有較強的抗氧化活性，隨著提取溫度的升高獲得的螺旋藻粗蛋白的活性逐漸增強，且明顯大于傳統(tǒng)方法提取的粗蛋白。

3.2 綜上所述，超聲耦合亞臨界水可有效提取螺旋藻中的蛋白，為提取海藻蛋白開創(chuàng)了一種高效、低耗、環(huán)保的新技術(shù)為今后制備海藻活性多肽的研究提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。