亞硫酸鈉輔助酶解蛋殼膜制備抗氧化多肽的工藝

趙婕媛，李曉云，黃茜

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，蛋品加工技術國家地方聯(lián)合工程中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蛋品加工重點實驗室，湖北武漢 430070）

生物活性肽是來自蛋白質水解產(chǎn)物由 2～20個氨基酸組成的短肽。這些肽對于人體健康方面有很多積極作用，如抗氧化活性，抗菌性，血管緊張素轉換酶（ACE）抑制作用和免疫調(diào)節(jié)作用等，當前，生物活性肽被廣泛應用于化妝品，食品添加劑，營養(yǎng)品和藥物等[1]。抗氧化肽像其他抗氧化劑一樣，可以保護機體免受由羥自由基，超氧化物，過氧化氫，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和 2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）自由基引起的損傷[2]，抑制脂質過氧化[3]?？寡趸囊部梢詰糜诒Ｗo食品，減少食品由氧化引起的變色和變質。與合成抗氧化劑相比，來自食品資源的抗氧化肽有易吸收，無毒副作用的優(yōu)點。目前，一些用作食品添加劑的合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚和丁基羥基甲苯因其毒性而開始受到限制[4]。因此，利用可行和高效的方法從自然資源獲得無毒的抗氧化劑用于替代合成抗氧化劑的食品添加劑具有非常重要的意義。

近年來，從天然來源尋找新的抗氧化劑用于取代食品和藥物材料中的合成抗氧化劑引起研究者極大的興趣。研究發(fā)現(xiàn)，天然存在于水果、蔬菜、種子中的維生素C、α生育酚和酚類化合物[5]等具有減少氧化損傷的能力，氧化損傷與癌癥、心血管疾病和動脈粥樣硬化等疾病有關。研究發(fā)現(xiàn)，許多來源于植物蛋白或者動物蛋白的蛋白水解物具有抗氧化活性，例如大豆蛋白[6]、米糠蛋白[7]、蛋黃蛋白[8]和豬肌原纖維蛋白[9]等。此外，水產(chǎn)品和副產(chǎn)品也是抗氧化肽的良好來源，例如海參[10]、沙丁魚副產(chǎn)物[4]。

近年來中國禽蛋產(chǎn)量逐年增長，2016年全國禽蛋產(chǎn)量 3095萬噸[11]。在禽蛋生產(chǎn)和消費過程中，禽蛋殼膜大量產(chǎn)生，按蛋殼膜重占蛋重的1.02%計算[12]，我國每年有31.57萬噸廢棄蛋殼膜產(chǎn)生，并且禽蛋殼膜主要作為廢棄物處理，造成了資源浪費和環(huán)境污染。蛋殼膜含有豐富的蛋白質，如膠原蛋白（I型，V型和X型）、骨橋蛋白、唾液蛋白、角蛋白、卵清蛋白等[13]，此外還含有約3%的脂質體和2%的糖類。國內(nèi)外對蛋殼膜蛋白及多肽的研究越來越多，研究發(fā)現(xiàn)蛋殼膜作為一種新型膳食補充劑，臨床上已顯示緩解關節(jié)炎關節(jié)疼痛和僵硬[14]，研究發(fā)現(xiàn)蛋殼膜的酶解產(chǎn)物的活性強于原蛋白，酶解產(chǎn)物具有清除 O2-·、OH·等自由基的活性，并且對DNA損傷有保護作用[15]，有研究利用蛋殼膜水解物制作化妝品[16]，因此蛋殼膜酶解物具有作為抗氧化食品添加劑、抗氧化化妝品的潛力，蛋殼膜具有高價值利用的潛力。因此采用適當方式將禽蛋殼加工成具有商業(yè)價值的產(chǎn)品，是提高禽蛋綜合價值，減少環(huán)境污染的有效途徑。本文旨在研究亞硫酸鈉輔助蛋白酶酶解蛋白酶制備具有高抗氧化活性的蛋殼膜多肽，以其為蛋殼膜產(chǎn)品的開發(fā)和應用提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

雞蛋殼膜，采購于黑龍江中農(nóng)興和生物科技有限公司。

堿性蛋白酶（2×105U/g）、胃蛋白酶（3×106U/g），neofroxx公司；木瓜蛋白酶（8×105U/g）、中性蛋白酶（1×105U/g）、胰凝乳蛋白酶（1.5×106U/g），上海源葉生物有限公司；SDS-PAGE試劑盒、Tricine-SDS-PAGE試劑盒、預染超低分子量蛋白質Marker（3.3 ku～31.0 ku），北京索萊寶科技有限公司；Fermentas預染蛋白Marker 10～250 ku，北京明陽科華生物科技有限公司；亞硫酸鈉、濃硫酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、鉬酸銨、磷酸鈉、甲醛等均為分析純，國藥集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Sigma3-30K高速冷凍離心機，美國Sigma公司；K9840半自動凱氏定氮儀，濟南華舜儀器有限公司；LSHZ-300全溫振蕩箱，蘇州培英實驗設備有限公司；HYP-308消化爐，上海纖檢儀器有限公司；Nanodrop 2000C紫外分光光度計，Thermo Fisher Scientific公司；Heidolph真空冷凍干燥機，Germany公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

雞蛋殼膜→加酶、亞硫酸鈉→恒溫震蕩水浴酶解→滅酶（80 ℃，20 min）→離心（3600 g，10 min）→上清液→透析→冷凍干燥→蛋殼膜酶解物

1.3.2 單因素實驗

1.3.2.1 酶的篩選

準確稱取5.000 g的雞蛋殼膜粉，按1：20的料液比加入30 mM的亞硫酸鈉溶液配置成雞蛋殼膜懸濁液，用1 M NaOH或1 M HCl調(diào)節(jié)pH至所用酶的最適pH，按9 U/mg的酶與底物蛋殼膜比分別加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，再在各個酶的最適溫度下持續(xù)震蕩6 h（胃蛋白酶采用pH為2.0，酶解溫度37 ℃，木瓜蛋白酶采用pH為6.5，酶解溫度60 ℃，糜蛋白酶采用pH 7.9，酶解溫度37 ℃，堿性蛋白酶采用pH為8.0，酶解溫度55 ℃，中性蛋白酶采用pH為7.5，酶解溫度45 ℃），取出，離心（3600 g，10 min），取部分上清液測定水解度。其余上清液使用截留分子量為1 ku的透析袋在4 ℃下透析24 h，冷凍干燥。以水解度和總抗氧化能力為指標確定雞蛋殼膜酶解最佳用酶。

1.3.2.2 加酶量的確定

在確定蛋白酶的基礎上，料液比、亞硫酸鈉濃度、酶解時間分別固定為1：20、30 mM、6 h，按3 U/mg、6 U/mg、9 U/mg、12 U/mg、15 U/mg的加酶量加入堿性蛋白酶或木瓜蛋白酶，以水解度和總抗氧化能力為指標，確定最優(yōu)的加酶量。

1.3.2.3 亞硫酸鈉濃度的確定

堿性蛋白酶加酶量為12 U/mg，料液比、酶解時間分別固定為1：20、6 h，亞硫酸鈉濃度分別為10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM，以水解度和總抗氧化能力為指標，確定亞硫酸鈉最適濃度。

1.3.2.4 酶解時間的確定

堿性蛋白酶加酶量為12 U/mg，料液比為1：20，亞硫酸鈉濃度為40 mM，酶解時間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，以水解度和總抗氧化能力為指標，確定最佳酶解時間。

1.3.3 游離氨基態(tài)氮含量測定：甲醛值法

游離氨基態(tài)氮含量采用中華人民共和國國家標準GB/T 5009.39-2003氨基態(tài)氮甲醛值法測定，實驗做三次平行。吸取5 mL樣品，加入60 mL蒸餾水，開動磁力攪拌器，用0.050 mol/L NaOH標準溶液滴定至酸度計指示pH 8.2，加入10.0 mL中性甲醛溶液，混勻。再用0.050 mol/L NaOH標準溶液繼續(xù)滴定至pH 9.2，記下消耗 NaOH標準溶液的體積，記為 V1。同時取65 mL蒸餾水，先用0.050 mol/L NaOH標準溶液調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加入10.0 mL中性甲醛溶液，繼續(xù)用NaOH滴定至pH 9.2，做為試劑空白試驗，記錄消耗NaOH的體積，記為V2。試樣中氨基酸態(tài)氮的含量計算公式：

注：X表示試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，單位為g/mL；V1表示測定試樣加入甲醛后消耗NaOH標準滴定溶液的體積，單位為mL；V2表示試劑空白實驗加入甲醛后消耗NaOH標準滴定溶液的體積，單位為mL；c表示NaOH標準滴定溶液的濃度，單位為mol/L；0.014表示與1 mL 1.000 mol/L NaOH標準滴定溶液相當?shù)牡馁|量，單位為g。

1.3.4 總氮含量測定

本試驗采用中華人民共和國國家標準食品中蛋白質的測定GB 5009.5-2016凱氏定氮法測定總氮含量。

1.3.5 水解度測定

根據(jù)文獻[17]的方法，實驗做三次平行。

1.3.6 總抗氧化能力測定

蛋殼膜肽總抗氧化能力是參照Huang Y等[18]人的研究方法進行測定的。方法如下：將蛋殼膜多肽配置成3 mg/mL的溶液，各取0.1 mL于10 mL的具塞試管中，加入5 mL配置好的試劑（4 mmol/L鉬酸銨、28 mmol/L磷酸鈉和0.6 mol/L濃硫酸），混勻，密封置于95 ℃的恒溫水浴鍋中反應90 min，取出后迅速冷卻至 25 ℃室溫，使用紫外分光光度計測定波長為695 nm處的吸光值（A695nm），以等體積的去離子水代替樣品溶液作為空白對照。同時用抗壞血酸溶液（0，100，200，300，400 μg/mL）作陽性對照，蛋白質水解物溶液的總抗氧化活性（TAA）表示為相當于抗壞血酸的量，實驗做三次平行。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

按照SDS-PAGE試劑盒說明書操作，簡言之，將蛋殼膜水解產(chǎn)物以1：4比例與上樣緩沖液混合。為了使蛋白質變性，將溶液煮沸 5 min，然后用于SDS-PAGE。樣品在80 V的疊加電壓和100 V的分辨電壓下進行SDS-PAGE?？捡R斯亮藍G-250用作染色液。

為了進一步確定蛋殼膜水解物在15 ku以下的分子量分布，進行了小分量電泳，按照Tricine-SDS-PAGE試劑盒說明書操作，使用16.5%的Tricine-SDS-PAGE凝膠對蛋殼膜多肽進行電泳，電泳結束后使用考馬斯亮藍G-250進行染色，分析。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

所有實驗進行 3次重復，單因素實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行One-way ANOVA分析，平均值之間用Duncan’s multiple range test進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 酶種類對蛋殼膜蛋白水解度和總抗氧化能力的影響

圖1 不同種類的蛋白酶對蛋殼膜總抗氧化活性和水解度的影響Fig.1 Effect of different kinds of proteases on total antioxidant activity and hydrolysis degree of eggshell membrane

母相同表示差異不顯著(p＞0.05)；字母不同表示差異顯著(p＜0.05)。

如圖1，對照組的水解度都在1%左右，說明水解蛋殼膜蛋白起主要作用的是蛋白酶。因為大多數(shù)酶酶解時有特異性切割位點，因此使用不同的酶可以生成具有不同氨基酸序列的多肽，同時酶的種類也可以影響多肽的生物活性和消化速度[19]。如圖1所示，五種酶中，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度顯著高于其它四種酶的酶解產(chǎn)物，最高達10.85%，與尤娟用蛋白酶酶解鰱魚魚肉蛋白得到的結果相似[20]，堿性蛋白酶酶解得到的水解度最大，其它四種蛋白酶的水解度在2.68%～7.89%。酶解產(chǎn)物的抗氧化活性從高到低依次是：堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞糜蛋白酶＞胃蛋白酶。木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物抗氧化活性最高，顯著高于其它三種酶的酶解產(chǎn)物（p＜0.05），總抗氧化能力分別為 198.00 μg/mL 和218.61 μg/mL，所以本實驗選擇木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶。這與周艷華用蛋白酶酶解蛋殼膜蛋白得到的結果相似[17]，都是堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物抗氧化活性較好，這可能是因為堿性蛋白酶酶解物的水解度較高，生成了具有更高抗氧化活性的短肽。

2.2 木瓜蛋白酶加酶量對蛋殼膜多肽水解度和總抗氧化能力的影響

圖2 木瓜蛋白酶加酶量對蛋殼膜總抗氧化活性和水解度的影響Fig.2 Effect of papain dosage on total antioxidant activity and degree of hydrolysis of eggshell membrane

酶解速度取決于加酶量，少量的酶不能完全酶解底物蛋白，如圖2所示，底物濃度不變，木瓜蛋白酶加酶量在0 U/mg～9 U/mg范圍內(nèi)，酶解物水解度隨加酶量增高呈快速上升趨勢。當加酶量達到9 U/mg后，水解度上升趨勢變緩，在 15 U/mg時達到最大值8.94%。木瓜蛋白酶加酶量在0 U/mg～12 U/mg范圍內(nèi)，隨木瓜蛋白酶加酶量的升高，總抗氧化能力呈現(xiàn)上升趨勢。當加酶量增高到12 U/mg時，總抗氧能力達到最大值為205.58 μg/mL，加酶量繼續(xù)增加到15 U/mg時，此時水解度繼續(xù)上升但總抗氧化能力出現(xiàn)下降，可能是木瓜蛋白酶繼續(xù)酶解，將抗氧化多肽酶解呈沒有抗氧化活性的肽段。

2.3 堿性蛋白酶加酶量對蛋殼膜多肽水解度和總抗氧化能力的影響

圖3 堿性蛋白酶加酶量對蛋殼膜總抗氧化活性和水解度的影響Fig.3 Effects of alkaline protease dosage on total antioxidant activity and degree of hydrolysis of eggshell membrane

如圖3所示，隨著加酶量的升高，酶解產(chǎn)物的水解度和總抗氧化能力逐漸上升，這是因為當?shù)孜餄舛炔蛔儠r，增加加酶量，增高了蛋白酶與底物接觸的機會[21]，底物被酶解的越充分生成的抗氧化活性肽量越多，因此水解度和酶解物的總抗氧化能力升高。當加酶量達到6 U/mg后，水解度趨于平穩(wěn)，這可能是因為底物蛋白濃度一定，加酶量超過一定量之后達到飽和[22]。加酶量為12 U/mg時，總抗氧化能力達到最大值230.73 μg/mL，顯著高于木瓜蛋白酶加酶量12 U/mg時的酶解物的總抗氧化能力，堿性蛋白酶加酶量增高到12 U/mg之后，總抗氧化能力略微下降，因此本實驗選擇堿性蛋白酶加酶量為12 U/mg。

2.4 Na2SO3濃度對蛋殼膜多肽水解度和總抗氧化能力的影響

如圖4所示，Na2SO3濃度在0～30 mM范圍內(nèi)，水解度隨 Na2SO3濃度升高呈上升趨勢，這表明低濃度Na2SO3有利于蛋殼膜酶解，與Hamada[23]研究結果一致。因為蛋殼膜蛋白中含有大量的二硫鍵，使得蛋白質結構緊密而難以被酶解[12]，Na2SO3可以斷裂二硫鍵[24]，使蛋白質更易與蛋白酶接觸，有利于蛋白質與蛋白酶之間相互作用，從而加速酶解。超過30 mM之后水解度呈下降趨勢，這可能是因為高濃度的亞硫酸鈉抑制了堿性蛋白酶的活性。Na2SO3濃度在0～40 mM范圍內(nèi)，總抗氧化能力隨 Na2SO3濃度升高呈上升趨勢，在40 mM時達到最大值238.61 μg/mL，超過40 mM之后總抗氧化能力下降，因此本實驗選擇40 mM的Na2SO3濃度，少量Na2SO3可以通過透析、超濾等方法去除。

圖4 Na2SO3濃度對蛋殼膜總抗氧化活性和水解度的影響Fig.4 Effect of sodium sulfite concentration on total antioxidant activity and hydrolysis degree of eggshell membrane

2.5 酶解時間對蛋殼膜多肽水解度和總抗氧化能力的影響

圖5 時間對蛋殼膜總抗氧化活性和水解度的影響Fig.5 Effect of time on total antioxidant activity and hydrolysis degree of eggshell membrane

圖5是堿性蛋白酶酶解時間對酶解產(chǎn)物水解度和總抗氧化能力的影響。可以看出，隨著酶解時間延長，禽蛋殼膜的水解度上升趨勢顯著，水解6 h水解度達到最大值11.29%，超過6 h后，其水解度沒有顯著性差異（p＞0.05）?？赡苁且驗樽畛醯孜餄舛容^高，酶與底物充分接觸，隨著水解時間延長，底物濃度降低，產(chǎn)物濃度升高，底物可水解位點的減少和產(chǎn)物的增多抑制了蛋白酶[25]?？偪寡趸芰﹄S著酶解時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在4 h時達到最大值245.88 μg/mL，這可能時因為初始階段禽蛋殼膜水解迅速，大量的肽鍵被水解，使得總抗氧化能力升高[26]，水解度對酶解產(chǎn)物的總抗氧化能力影響顯著，因為水解度顯著影響肽鏈長度和產(chǎn)物的末端氨基酸殘基[27]，酶解時間延長，水解度先上升后趨于平穩(wěn)，水解度升高，可能導致多肽被進一步水解成不具有抗化活性的短肽或者氨基酸，因此導致總抗氧化能力下降，本實驗選擇酶解時間4 h。

2.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

圖6 不同樣品的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE iamge of different samples

如圖6所示，Na2SO3處理組產(chǎn)物的分子量明顯高于加酶組，在130 ku附近有條帶，推測是膠原蛋白的α鏈，在250 ku附近的條帶推測是膠原蛋白的β鏈，在35～55 ku之間的條帶推測是酶解后的角蛋白。堿性蛋白酶在25 ku附近和低于10 ku出現(xiàn)條帶。堿性蛋白酶處理組分子量明顯低于Na2SO3處理組，在25 ku附近和10 ku附近有條帶。堿性蛋白酶和Na2SO3共同處理組在25 ku以下尤其是10 ku附近的的組分含量明顯高于單獨堿性蛋白酶處理組和單獨Na2SO3處理組。

如圖7所示，Na2SO3處理組產(chǎn)物主要分布于大于31 ku的部分，堿性蛋白酶處理組高于31 ku的部分少于Na2SO3處理組，低于14.4 ku的部分少于堿性蛋白酶和Na2SO3共同處理組。堿性蛋白酶在4 ku和31 ku處有兩條條帶，堿性蛋白酶和 Na2SO3共同處理組產(chǎn)物的分子量主要集中在3.3～14.4 ku。

圖7 不同樣品的Tricine-SDS-PAGE圖Fig.7 Tricine-SDS-PAGE iamge of different samples

3 結論

3.1 本研究以綠色安全高效的 Na2SO3輔助生物酶解的方法，通過單因素實驗優(yōu)化了酶解條件，即采用12 U/mg堿性蛋白酶聯(lián)合40 mM Na2SO3酶解4 h，產(chǎn)物的水解度為8.58%，總抗氧化能力達到245.88 μg/mL，具有較好的抗氧化能力。

3.2 采用SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE分析酶解產(chǎn)物的分子量分布，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)條件的蛋殼膜酶解產(chǎn)物的分子量分布在3.3～14.4 ku。為了提高抗氧化肽的純度以期獲得更好的抗氧化活性，本實驗后續(xù)將進行更深入的研究，具體包括：運用凝膠過濾技術分離純化酶解產(chǎn)物，對純化前后多肽的抗氧化活性進行對比等。

3.3 綜上，本實驗以 Na2SO3輔助堿性蛋白酶酶解的方法，通過酶解條件優(yōu)化得到了高抗氧化能力的酶解產(chǎn)物，為禽蛋殼膜的深加工利用奠定了理論基礎。因此，禽蛋殼膜酶解的蛋殼膜多肽可以作為抗氧化、抗衰老的功能性食品或者化妝品，禽蛋殼膜具有高價值利用的潛力。