外源H2S緩解黃瓜種子萌發(fā)過(guò)程中干旱脅迫傷害的生理機(jī)制

牟雪姣，張遠(yuǎn)兵，吳 燕，張 強(qiáng)

(安徽科技學(xué)院 建筑學(xué)院，安徽蚌埠 233100)

黃瓜(CucumissativusL.) 是世界各國(guó)普遍栽培的重要蔬菜作物之一，其消費(fèi)量大，種植面積逐年增加。黃瓜屬淺根性作物，不同生育時(shí)期需水量都很高，發(fā)芽期要求更高，水分不足則發(fā)芽緩慢，整齊度差。干旱是黃瓜育苗階段存在的主要問(wèn)題，也是影響黃瓜產(chǎn)量的重要因素之一[1-2]。因此，探索外源物質(zhì)對(duì)黃瓜干旱脅迫的緩解作用，提高黃瓜對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性已成為黃瓜生產(chǎn)栽培中亟待解決的重要問(wèn)題之一。

硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮(Nitric oxide，NO)和一氧化碳(Carbon monoxide, CO)之后的第3種氣體信號(hào)分子，廣泛分布于生物體內(nèi)[3]。H2S在植物的正常生理和逆境脅迫中均發(fā)揮著非常重要的作用，能夠顯著提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性[4]。近年來(lái)，關(guān)于外源H2S提高植物抗旱性的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展。有研究表明，H2S可以通過(guò)上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等抗氧化酶的活性來(lái)降低甘薯幼苗中H2O2的水平，進(jìn)而提高其抗旱性[5]；也可以通過(guò)調(diào)控谷胱甘肽和抗壞血酸代謝來(lái)減緩干旱脅迫對(duì)小麥幼苗造成的氧化傷害[6]；H2S還可以誘導(dǎo)干旱脅迫條件下蠶豆和鳳仙花植株葉片的氣孔關(guān)閉，減少水分蒸騰，以緩解干旱脅迫[7]。此外，外源H2S還能夠通過(guò)提高最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和電子傳遞速率(ETR)等減輕干旱脅迫對(duì)小麥植株光系統(tǒng)Ⅱ的損傷，保證光合作用的順利進(jìn)行[8]。但外源H2S對(duì)萌發(fā)生長(zhǎng)期黃瓜干旱脅迫緩解作用的研究迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)以黃瓜種子為材料，采用聚乙二醇(PEG-6000)模擬干旱脅迫，從生長(zhǎng)指標(biāo)、質(zhì)膜透性和膜脂過(guò)氧化、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及水解酶和抗氧化保護(hù)酶活性等角度，研究外源H2S對(duì)萌發(fā)生長(zhǎng)期黃瓜干旱脅迫的緩解效果與作用機(jī)制，為H2S作為抗旱誘導(dǎo)劑在黃瓜生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

供試黃瓜品種‘新津研四號(hào)’由天津市中天種業(yè)有限公司提供。挑選籽粒飽滿、大小均勻且無(wú)病蟲(chóng)傷害的黃瓜種子，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%氯化汞溶液消毒10 min，再用自來(lái)水和蒸餾水分別沖洗3次，晾干。將晾干后的黃瓜種子用蒸餾水或1 mmol·L-1NaHS溶液(H2S的供體)于25 ℃下浸種8 h，隨后，將種子轉(zhuǎn)入墊有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿20粒。分別向皿中加入蒸餾水或10% PEG6000溶液6 mL，然后將皿置于PYX-250S-A 型生化培養(yǎng)箱中，在25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。每天定時(shí)向皿中補(bǔ)充0.5 mL(水分蒸發(fā)量)蒸餾水，以維持試驗(yàn)條件的恒定。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，分別為①對(duì)照組(CK)：蒸餾水浸種，蒸餾水培養(yǎng)；②PEG：蒸餾水浸種，PEG6000培養(yǎng)；③NaHS：NaHS浸種，蒸餾水培養(yǎng)；④PEG+NaHS：NaHS浸種，PEG6000培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)5皿，在處理的第2天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第3天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，第4天進(jìn)行生理和生化指標(biāo)的測(cè)定，第6天測(cè)量胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)及鮮質(zhì)量。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 以芽長(zhǎng)≥1/2 種子長(zhǎng)度作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，按下式計(jì)算發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率：

發(fā)芽勢(shì)=規(guī)定天數(shù)內(nèi)發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù)×100%

發(fā)芽率=全部發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%

每皿抽取10株，用直尺測(cè)量胚軸長(zhǎng)和根長(zhǎng)；用蒸餾水洗凈并用濾紙吸干表面水分后，用萬(wàn)分之一天平稱量鮮質(zhì)量。

1.2.2 水解酶活性測(cè)定 淀粉酶活性的測(cè)定采用3，5 - 二硝基水楊酸比色法[9]；酯酶活性的測(cè)定采用固蘭B鹽顯色法[10]。

1.2.3 抗氧化酶同工酶電泳 將1 g樣品與3 mL提取液[0.05 mmol·L-1pH 7.8磷酸緩沖液，內(nèi)含5 mmol·L-1β-巰基乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)]混合于研缽中，再加少量石英砂，冰浴研磨至勻漿，4 ℃離心(10 000 ×g，30 min)，上清液為待測(cè)酶液。

抗氧化酶同工酶電泳參照王松華等[11]的方法。其中SOD(EC1.15.1.1) 同工酶電泳分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)作為染色劑；過(guò)氧化物酶(POD；EC1.11.1.7)和CAT(EC1.11.1.6) 的同工酶電泳分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%，濃縮膠濃度為5%，其中POD同工酶電泳用醋酸聯(lián)苯胺染色，CAT同工酶電泳用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%鐵氰化鉀和2%氯化高鐵染色。

1.2.4 根質(zhì)膜透性測(cè)定 用伊文思藍(lán)染色法測(cè)定根的質(zhì)膜透性[12]。將根用0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液洗凈，濾紙吸干，放入伊文思藍(lán)染液(0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液，pH 5.6，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%的伊文思藍(lán))中染色10 min，再用0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液漂洗至無(wú)藍(lán)色析出，最后用濾紙吸干表面并拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 其他生理指標(biāo)的測(cè)定 電解質(zhì)滲漏率和丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度的測(cè)定參照Michael等[13]的方法；可溶性糖和游離脯氨酸(Pro)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定分別采用蒽酮比色法和茚三酮顯色法，具體參照李合生等[14]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS 7.05軟件中的Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析， 用OriginPro 9.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2S對(duì)黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響

發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)和鮮質(zhì)量等是反映植株生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)。由表1可以看出，PEG脅迫處理的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)和鮮質(zhì)量等指標(biāo)均顯著低于CK(P<0.05)，表明干旱脅迫對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)生長(zhǎng)有顯著的抑制作用；NaHS單獨(dú)處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與CK相比差異并不顯著，但其根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)和鮮質(zhì)量均顯著優(yōu)于CK(P<0.05)，說(shuō)明NaHS處理對(duì)黃瓜種子的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用；與PEG脅迫處理相比，NaHS+PEG處理的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著提高，說(shuō)明外源H2S能顯著緩解干旱脅迫對(duì)黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)的抑制作用。

表1 H2S對(duì)干旱脅迫下黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of H2S on germination and growth of cucumber seeds under drought stress

注:數(shù)據(jù)為3次測(cè)量的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異達(dá)0.05顯著水平。

Note:Data are “means ±standard deviation”(n = 3).Different lowercase letters in the same columns indicate significant difference among different treatments at 0.05 level.

2.2 H2S對(duì)質(zhì)膜透性和膜脂過(guò)氧化的影響

干旱脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA大量累積，同時(shí)，質(zhì)膜通透性增大，電解質(zhì)大量外滲。因此，可通過(guò)MDA質(zhì)量摩爾濃度變化判斷植株的膜脂過(guò)氧化水平；根據(jù)電解質(zhì)滲漏率及根染色情況判定質(zhì)膜的完整性。

從圖1-A、B可以看出，與CK相比，PEG脅迫處理的電解質(zhì)滲漏率和MDA質(zhì)量摩爾濃度均顯著上升，而NaHS處理則無(wú)明顯變化；PEG+NaHS處理的電解質(zhì)滲漏率和MDA質(zhì)量摩爾濃度盡管較CK顯著升高，但顯著低于PEG脅迫處理。從圖1-C可以看出，各處理的根經(jīng)伊文思藍(lán)染色后，均呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色，其中PEG脅迫處理的根顏色較CK明顯加深，NaHS處理的根顏色與CK相差不大，而PEG+NaHS處理的根顏色比CK略深，但明顯淺于PEG脅迫處理。圖1表明，H2S的供體NaHS對(duì)正常生長(zhǎng)環(huán)境條件下黃瓜的質(zhì)膜透性和膜脂過(guò)氧化無(wú)明顯影響，但對(duì)干旱脅迫條件下黃瓜質(zhì)膜透性的增大和膜脂過(guò)氧化水平的加重有顯著的抑制作用。

2.3 H2S對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

Pro和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們能維持細(xì)胞膨壓，并有利于保持膜結(jié)構(gòu)的完整[15]。由圖2可知，與CK相比，其他各處理均能顯著提高黃瓜種子的Pro和可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P<0.05)，但以PEG+ NaHS處理的Pro和可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加幅度最大，分別比CK提高43.78%和16.29%，表明外源H2S能夠在黃瓜種子自身響應(yīng)干旱脅迫的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高黃瓜種子中Pro和可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以提升黃瓜種子對(duì)干旱脅迫的抗性。

2.4 H2S對(duì)水解酶活性的影響

淀粉酶和酯酶都是黃瓜種子萌發(fā)過(guò)程中不可或缺的重要酶類。他們能夠?yàn)橹参锱吒团哐可L(zhǎng)及器官建成提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來(lái)源。從圖3可以看出，淀粉酶和酯酶活性均以PEG+NaHS處理最高，其次為NaHS處理，再次為PEG脅迫處理，而CK處理的淀粉酶和酯酶活性均最低，各處理間2種酶活性的差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)，說(shuō)明外源H2S能夠顯著增強(qiáng)黃瓜種子萌發(fā)期間淀粉酶和酯酶的活性，進(jìn)而提高其對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性。

A.電解質(zhì)滲漏率Electrolyte leakage rate;B.MDA質(zhì)量摩爾濃度MDA molality；C.根質(zhì)膜透性Plasma membrane integrity of roots

圖上不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平差異顯著。下同 Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level．The same below

圖1外源H2S對(duì)黃瓜種子質(zhì)膜透性和膜脂過(guò)氧化的影響
Fig.1EffectsofexogenousH2Sonplasmamembranepermeabilityandmembranelipidperoxidationduringgerminationandgrowthofcucumberseeds

2.5 H2S對(duì)抗氧化酶同工酶的影響

SOD、POD和CAT是細(xì)胞抵御活性氧傷害的重要保護(hù)酶系統(tǒng)，可以清除植物體內(nèi)多余的活性氧，抑制膜脂過(guò)氧化作用。由圖4-A可知，SOD同工酶有4條酶帶，與CK相比，其他各處理的酶帶均變寬，亮度增強(qiáng)，以PEG+NaHS處理最為明顯；由圖4-B可以看出，POD同工酶帶為2條，與CK相比，其他各處理的POD酶帶均變寬，顏色加深，仍以PEG +NaHS處理變化最為明顯；圖4-C的結(jié)果顯示，CAT同工酶僅有1條酶帶，與CK相比，其他各酶帶的寬度及亮度變化趨勢(shì)與SOD同工酶相同。圖4結(jié)果表明，外源PEG處理或H2S處理均能促進(jìn)黃瓜種子萌發(fā)期間SOD、POD和CAT同工酶的活性，但以PEG+NaHS處理的作用效果最為顯著，說(shuō)明外源H2S能夠在黃瓜種子自身響應(yīng)干旱脅迫的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增強(qiáng)其抗氧化防御系統(tǒng)，以減緩干旱脅迫對(duì)其造成的損傷。

圖2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.2 Changes of substance mass fraction by osmotic adjustment

圖3 水解酶活性的變化Fig.3 Changes of hydrolase activities

A.超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase；B.過(guò)氧化物酶 Peroxidase；C.過(guò)氧化氫酶 Catalase

3 討 論

干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成的重要環(huán)境因素之一。在干旱脅迫條件下，植株的生長(zhǎng)會(huì)明顯受到抑制，同時(shí)體內(nèi)會(huì)發(fā)生明顯的生理和生化變化。一方面，植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧會(huì)迅速積累，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化損傷，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，質(zhì)膜透性增強(qiáng)；另一方面，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和保護(hù)酶的活性也會(huì)根據(jù)脅迫程度的不同發(fā)生相應(yīng)變化[16-17]。本研究中，干旱脅迫顯著抑制黃瓜種子的萌發(fā)，并導(dǎo)致質(zhì)膜損傷和電解質(zhì)外滲，MDA質(zhì)量摩爾濃度也顯著增加，類似的結(jié)果在胡蘿卜[18]和水稻[19]中均有報(bào)道。此外，干旱脅迫也誘導(dǎo)黃瓜種子的適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)，表現(xiàn)為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增多，水解性和抗氧化酶活性增強(qiáng)，這與Zhang等[5]和Wegener等[20]的報(bào)道一致。

H2S作為一種非常重要的信號(hào)分子，在植物逆境脅迫下發(fā)揮重要作用，能夠緩解植物體的逆境(干旱脅迫、鹽脅迫、熱激傷害和離子毒害等)傷害，提高植株對(duì)逆境的抗性[21]。本研究結(jié)果顯示，PEG+NaHS處理組黃瓜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量均顯著超過(guò)PEG脅迫組，說(shuō)明H2S 對(duì)干旱脅迫下黃瓜種子的萌發(fā)生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，這與劉晶等[22]的研究觀點(diǎn)一致。

可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累有利于維持干旱脅迫下植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)。吳單華等[23]研究證實(shí)，外源H2S 能提高干旱脅迫下小麥幼苗可溶性糖和脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，維持干旱脅迫時(shí)的滲透水平。本研究中，PEG脅迫組的可溶性糖和脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈上升趨勢(shì)，PEG+NaHS 處理進(jìn)一步提升黃瓜種子的可溶性糖和脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，使干旱脅迫條件下黃瓜種子的細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性得到維持，避免膜結(jié)構(gòu)的破壞和細(xì)胞脫水，這是H2S增強(qiáng)黃瓜種子抗旱能力的首要因素。

種子在萌發(fā)期間需要許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量以維持其旺盛的生命活動(dòng)[24]，這些養(yǎng)分和能量大多來(lái)自種子中淀粉、脂肪等貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和利用，而此過(guò)程離不開(kāi)淀粉酶、酯酶等水解酶的催化作用。Huang等[12]研究表明，外源H2S可使鎘脅迫下小麥種子淀粉酶和酯酶活性顯著增強(qiáng)；Zhang等[25-26]研究證實(shí)，H2S對(duì)小麥Cu2+和Al3+脅迫的緩解作用是由于H2S 提高了小麥淀粉酶同工酶和酯酶同工酶的活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，外源H2S能顯著提高干旱脅迫條件下黃瓜種子淀粉酶和酯酶的活性，以促進(jìn)貯藏物質(zhì)的水解，滿足黃瓜種子萌發(fā)及生長(zhǎng)所需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這是H2S提高黃瓜種子對(duì)干旱脅迫抗性的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

SOD、CAT和POD等是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，它們協(xié)調(diào)作用，能有效清除植物體內(nèi)的活性氧和過(guò)氧化物，緩解各種非生物脅迫對(duì)植物的損害[27]。Jin等[28]研究表明，外源H2S可刺激植物體內(nèi)與干旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，以調(diào)節(jié)活性氧代謝，并提高植株體內(nèi)的抗氧化酶水平。本試驗(yàn)中，PEG脅迫組的SOD、CAT和POD水平均較CK明顯升高，這是植物保護(hù)酶系統(tǒng)應(yīng)激反應(yīng)的表現(xiàn)；PEG+NaHS處理組的SOD、CAT和POD活性較PEG脅迫組進(jìn)一步提高，并有效抑制了PEG脅迫下MDA質(zhì)量摩爾濃度的增加及電解質(zhì)滲漏率和質(zhì)膜透性的增強(qiáng)，表明外源H2S能通過(guò)提高黃瓜種子的抗氧化酶水平，有效清除自由基，從而緩解了干旱脅迫導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化傷害，這是H2S提高黃瓜種子對(duì)干旱脅迫適應(yīng)性的又一重要機(jī)制。

然而，植物細(xì)胞對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，可能會(huì)有其他信號(hào)物質(zhì)的參與，也會(huì)涉及許多復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。外源H2S對(duì)黃瓜種子萌發(fā)期間干旱脅迫的緩解作用絕不僅限于上述機(jī)制，必然還包括基因表達(dá)及代謝調(diào)控等更為復(fù)雜的生理生化過(guò)程，這些都還有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

干旱脅迫對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)有明顯的抑制作用，并導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化和質(zhì)膜透性增加。外源H2S 可通過(guò)改善黃瓜種子的滲透調(diào)節(jié)能力，提高水解酶活性，提升SOD、CTA和POD抗氧化保護(hù)酶水平來(lái)增強(qiáng)其對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性，促進(jìn)干旱脅迫下黃瓜種子的萌發(fā)。