高溫脅迫對(duì)小麥花藥葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及RuBP羧化酶基因表達(dá)的影響

侯澤豪，張迎新,2，王 歡，孫坤坤，方正武，馬東方，張改生，王書平

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/湖北省澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北荊州 434025；2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/小麥育種教育部工程研究中心，陜西楊凌 712100)

高溫脅迫是指植物體由于周圍生長(zhǎng)環(huán)境溫度過(guò)高而引起的植物生理性傷害。近年來(lái)，隨著大氣中CO2和其他溫室氣體排放量的逐年升高，地球表面平均溫度也在日益增高，高溫脅迫給全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了極大危害[1-2]。有關(guān)溫度變化對(duì)全球谷物供應(yīng)的研究表明，大氣溫度的升高將會(huì)導(dǎo)致全球谷物大幅度減產(chǎn)[3-4]。因此，有關(guān)高溫脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響也備受關(guān)注[2,5-6]。

葉綠體是進(jìn)行光合作用的重要場(chǎng)所，而葉綠素是葉綠體的主要成分，也是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多少更是衡量植物光合效率的重要生理指標(biāo)之一，因此，對(duì)葉綠素的提取及質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定一直是植物生化研究的重要內(nèi)容。研究已經(jīng)表明，葉綠素對(duì)溫度的變化最為敏感，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多少則直接影響光合效率的強(qiáng)弱[7-9]。而高溫脅迫對(duì)不同植物葉綠素的影響也不盡相同，花生幼苗在高溫42 ℃處理過(guò)程中，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，具體表現(xiàn)為初期下降幅度平緩，后期變化明顯[10]。而銀杏在45 ℃高溫脅迫下葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)則增加[11]。高溫脅迫下春小麥旗葉葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)從灌漿期到成熟期明顯降低[12]；因此，研究和揭示高溫脅迫下小麥花藥葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化規(guī)律，將更有助于降低高溫對(duì)小麥葉綠素的破壞，確保小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。

1,5-二核酸核酮糖羧化酶(RuBPcase)目前被認(rèn)為是對(duì)溫度最敏感的光合酶，并且是決定C3植物光合碳代謝方向和效率的關(guān)鍵酶。研究表明，RuBPcase是高溫抑制卡爾文循環(huán)的主要發(fā)生位點(diǎn)。Nakano等[13]研究發(fā)現(xiàn)，溫度脅迫可能導(dǎo)致光合作用暗反應(yīng)中CO2同化的關(guān)鍵酶RuBPcase的活性受到影響。黃瓜幼苗在高溫(42 ℃/32 ℃)脅迫下的RuBP羧化酶(RuBPCase)和Rubisco活化酶(RCA)活性及其mRNA表達(dá)量逐漸降低，而在亞高溫(35 ℃/25 ℃)下的脅迫初期變化不大，后期開始趨于降低[14]。玉米的成熟葉片和幼嫩葉片在高溫脅迫下RuBP羧化酶的活性則顯著降低[15]。而薛偉等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫使作物葉片RuBPcase的活性先增加后降低，最終造成光合性能下降，導(dǎo)致葉片衰老加速。而鮮見有關(guān)高溫脅迫下小麥花藥葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、RuBP羧化酶活性及其基因表達(dá)的研究。

小麥的花藥壁中也存在大量的葉綠體，這些葉綠體能夠進(jìn)行光合作用，其產(chǎn)物是花藥絨氈層、胼胝質(zhì)生長(zhǎng)和花粉粒發(fā)育的重要物質(zhì)和能量來(lái)源之一[17]，一旦該生理過(guò)程發(fā)生紊亂，必然會(huì)導(dǎo)致雄性不育，進(jìn)而造成花藥敗育甚至絕收。本研究以小麥不同發(fā)育時(shí)期的花藥為材料，比較分析高溫脅迫對(duì)小麥花藥葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、RuBP羧化酶活性及其基因表達(dá)的影響，旨在揭示高溫脅迫下小麥花藥敗育過(guò)程中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化規(guī)律及光合碳代謝關(guān)鍵酶的響應(yīng)過(guò)程，探索小麥高溫脅迫響應(yīng)機(jī)制，對(duì)提高小麥的耐熱性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料處理

供試小麥品種為‘西農(nóng)1376’。待花藥發(fā)育至單核早期，于人工氣候室中進(jìn)行高溫脅迫處理，設(shè)置溫度分別為(42±1) ℃(高溫脅迫處理) 和(25±1) ℃(對(duì)照),濕度為(70±5)%，每天處理3 h，共3 d，此時(shí)花藥已發(fā)育至單核后期。4 ℃分別收集單核后期、二核期、三核期的花藥，取樣時(shí)期的確定按Wang等[18-19]的方法進(jìn)行。

1.2 穗部形態(tài)學(xué)觀察

采用數(shù)碼相機(jī)獲取小麥穗部圖像，新鮮收集的成熟花粉粒采用w=2% I2-KI染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 葉綠素提取

葉綠素的提取參照李得孝等[20]的方法并略加修改，取0.25 g小麥花藥，立即置于浸提液[V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1]中，在25 ℃恒溫?fù)u床(110 r/min，避光)下浸提18 h，經(jīng)過(guò)濾、洗滌后定容至25 mL，并立即在645 nm和663 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Amon法修正公式計(jì)算葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)[21]：

葉綠素a(mg/g)=(12.71×A663-2.59×A645)×V/W

葉綠素b(mg/g)=(22.88×A645-4.67×A663)×V/W

葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)=(8.04×A663+20.29×A645)×V/W

式中：A663、A645分別為663 nm、645nm 波長(zhǎng)下的吸光度，V為提取液的體積，W為花藥的鮮質(zhì)量。

1.4 RuBP羧化酶提取及活性測(cè)定

RuBP 羧化酶的提取按萇建峰等[22]的方法進(jìn)行，并略加修改。取小麥花藥0. 25 g(鮮質(zhì)量) 置于預(yù)冷的研缽中，加入2 mL 預(yù)冷的100 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液[φ=10%甘油、w=1% PVP、1 mmol/L EDTA、7 mmol/L 巰基乙醇，pH 7.8]，冰浴中研磨，勻漿后于4 ℃下15 000 g 離心20 min,取上清液待測(cè)。RuBP 羧化酶酶活性參照魏愛麗等[23]的分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 熒光定量PCR分析

按照Trizol Reagent Kit(Invitrogen公司)的操作說(shuō)明，提取總RNA。經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量后，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司)的操作說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成。熒光定量PCR采用SYBR Premix ExTaq試劑盒(TaKaRa公司)在CFX96RealTime PCR System上進(jìn)行，按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。使用Actin基因作為內(nèi)參基因，并利用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，所檢測(cè)基因和特異引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3次測(cè)量。采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用Origin 9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析及繪制圖表。

表1 相關(guān)基因熒光定量PCR引物Table 1 Specific primers in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生雄性不育

對(duì)高溫脅迫后的植株觀察發(fā)現(xiàn)，散粉后，可育穗因自花授粉穎殼表現(xiàn)為閉合(圖1-A)，成熟花粉粒含有豐富的淀粉粒而被I2-KI溶液染成深藍(lán)色(圖1-C)。相反，高溫脅迫后的花藥細(xì)胞質(zhì)稀薄，其花粉粒敗育比較徹底沒(méi)有淀粉積累(圖1-D)，且在沒(méi)有接授外源花粉的情況下，不育穗的穎殼保持張開狀態(tài)(圖1-B)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析其雄性不育率均在98%～100%，飽和授粉結(jié)實(shí)率均在98%以上，表明高溫脅迫對(duì)子房的發(fā)育基本沒(méi)有影響，而對(duì)花藥是否可育起著決定性的作用。

A.對(duì)照組 Control；B.高溫處理組 High-temperature stress；C、D.成熟花粉粒I2-KI染色比較觀察 Comparison of matured pollen grain by I2-KI staining

圖1小麥形態(tài)學(xué)比較觀察
Fig.1Comparisonofmorphologicalfeaturesofwheatplants

2.2 高溫脅迫對(duì)小麥花藥葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖2可知，高溫處理及對(duì)照的花藥葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨發(fā)育時(shí)期呈持續(xù)下降的趨勢(shì)。正常發(fā)育的小麥花藥經(jīng)高溫脅迫后，其葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)在單核后期、二核期和三核期分別顯著降低8.58%、23.87%和33.68%。與葉綠素a相比，葉綠素b對(duì)高溫脅迫更為敏感，在相應(yīng)發(fā)育時(shí)期的降幅較大，分別比對(duì)照降低20.07%(單核后期)、39.81%(二核期)和44.91%(三核期)。這使得高溫脅迫下花藥總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對(duì)照顯著降低12.55%(單核后期)、29.89%(二核期)和39.11%(三核期)。

2.3 高溫脅迫對(duì)花藥中RuBP羧化酶活性影響

RuBP羧化酶是光合作用中羧化階段的關(guān)鍵酶，其活力的高低直接決定著光合碳同化的速率。因此，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的小麥花藥的RuBP羧化酶活性進(jìn)行分析(圖3)。結(jié)果顯示，RuBP羧化酶的活性與花藥的發(fā)育時(shí)期呈負(fù)相關(guān)，即隨花藥發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)而逐漸降低。與對(duì)照相比，高溫脅迫從單核后期開始顯著減低花藥中RuBP羧化酶的活性，為對(duì)照的73.53%。且隨著后期的發(fā)育而不斷加劇，二核期時(shí)是對(duì)照的65.62%。而在花藥發(fā)育至三核期時(shí)差異達(dá)到最大，僅是對(duì)照的52.05%。

“*”表示處理間的差異顯著，下同

“*”mean significant among treatments，the same below

圖2高溫脅迫對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的花藥
葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較分析
Fig.2Comparativeanalysisofchlorophyllmassfractionofantheratdifferentdevelopmentperiodsunderhightemperaturestress

圖3 高溫脅迫對(duì)不同發(fā)育時(shí)期花藥的RuBP羧化酶活性的比較分析Fig.3 Comparative analysis of activity of RuBPcase of anther at different development periods under high temperature stress

2.4 高溫脅迫對(duì)花藥中RuBP基因表達(dá)模式的分析

進(jìn)一步采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)RuBP羧化酶的表達(dá)水平，結(jié)果表明，在整個(gè)花藥發(fā)育過(guò)程中，RuBP羧化酶的表達(dá)水平與其活性的變化趨勢(shì)保持一致，也隨發(fā)育時(shí)期的推進(jìn)而下降，且高溫脅迫顯著減低RuBP羧化酶的表達(dá)水平(圖4)，分別比對(duì)照降低16.56%(單核后期)、35.48%(二核期)和56.56%(三核期)。

3 討 論

小麥在生殖生長(zhǎng)階段，孢原細(xì)胞經(jīng)過(guò)平周分裂形成初生壁細(xì)胞和造孢細(xì)胞，造孢細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育為小孢子母細(xì)胞，小孢子母細(xì)胞再經(jīng)2次減數(shù)分裂和2次有絲分裂形成有3個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的成熟花粉粒[18,24]。因此，成熟花粉粒的形成過(guò)程需要嚴(yán)格遵循細(xì)胞分裂周期的發(fā)育程序，一旦該程序被干擾，則會(huì)出現(xiàn)花粉敗育[18,25]。當(dāng)外界環(huán)境溫度達(dá)到一定的閾值時(shí)，將有可能引起小麥花藥分裂周期的紊亂而產(chǎn)生敗育。本研究中，正常生長(zhǎng)發(fā)育的小麥花藥，經(jīng)高溫脅迫后，小孢子發(fā)生徹底的敗育，且敗育效果穩(wěn)定，但子房仍能維持較高結(jié)實(shí)能力。這為非生物脅迫下小麥生殖生長(zhǎng)、花粉發(fā)育的研究提供了理想的材料，也為研究作物耐熱性的分子遺傳基礎(chǔ)及提高作物的抗熱性提供了捷徑。s

圖4 小麥花藥中RuBPcase基因表達(dá)水平分析Fig.4 Comparative analysis of relative expression of RuBPcase gene of anther

葉綠素是植物體內(nèi)葉綠體的重要組成成分，是植物光合作用中吸收光的主要色素，能將捕捉到的光能轉(zhuǎn)化為生物能，為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量。處于生殖發(fā)育時(shí)期的花藥，則需要更多的物質(zhì)和能量來(lái)確保小孢子母細(xì)胞順利形成成熟花粉粒，而花藥壁中的葉綠體是這些物質(zhì)和能量來(lái)源的重要器官之一[17]，因此葉綠素與雄性不育有著密切的關(guān)系。李冰等[26]以赤茄和栽培品種遠(yuǎn)緣雜交選育得到的核質(zhì)互作型雄性不育系‘052506’和其保持系‘052507’為材料，測(cè)定分析葉片葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示不育系葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)幼苗期低于保持系，盛花期和保持系相近，結(jié)實(shí)期高于保持系。高國(guó)訓(xùn)等[27]的研究結(jié)果認(rèn)為在芹菜不育系的花器官中，葉綠素a和葉綠素b均低于其保持系。本研究中，在高溫脅迫的初期已經(jīng)對(duì)花藥的葉綠素合成系統(tǒng)產(chǎn)生影響，且與花藥的發(fā)育呈正相關(guān)，脅迫初期葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降幅度小于葉綠素b，主要原因是葉綠素b對(duì)溫度更為敏感[28]。

在高等植物中，具有不同光合碳循環(huán)途徑的植物其碳同化受高溫的影響也各異，其中，CAM(景天酸代謝)植物對(duì)高溫最不敏感，C4植物對(duì)高溫有較高的抗性，而C3植物則對(duì)高溫極為敏感[29]。RuBP羧化酶/加氧酶是處于光合碳還原和光合碳氧化兩個(gè)方向相反但又相互連鎖的循環(huán)交叉點(diǎn)上，它對(duì)凈光合速率起著決定性的作用，也是光合碳同化的關(guān)鍵酶，一直以來(lái)是眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)[13]。本研究中，高溫脅迫導(dǎo)致了光合作用暗反應(yīng)中的RuBP羧化/加氧酶的羧化效率受到影響，脅迫后花藥各個(gè)時(shí)期的RuBP羧化酶活性及表達(dá)水平均顯著降低(圖3和圖4)。過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致光合作用暗反應(yīng)中的RuBP羧化/加氧酶的羧化效率下降進(jìn)而導(dǎo)致凈光合速率下降，而下降到一定程度時(shí)，植物將失去自養(yǎng)能力[30]。這對(duì)于生殖器官花藥來(lái)說(shuō)，則表現(xiàn)為敗育。