生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前期Ⅰ染色體標(biāo)本制作方法改進(jìn)?

蘇 愛 李藝帆 毋亞仙 劉 穎 徐宏偉△

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 1 細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室； 2 2016級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè), 青島 266071)

人類許多遺傳性疾病的發(fā)生均是由于染色體減數(shù)分裂異常所致[1-2],因此熟練掌握細(xì)胞減數(shù)分裂過程中不同時(shí)期的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,是醫(yī)務(wù)工作者必須具備的基本技能,也是醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目[3]。在本實(shí)驗(yàn)中,生殖細(xì)胞減數(shù)分裂染色體標(biāo)本的制作質(zhì)量是決定該實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如何提高分裂各期細(xì)胞檢出率,以方便學(xué)生充分利用有限課時(shí),高效快捷地觀察生殖細(xì)胞各個(gè)時(shí)期染色體形態(tài)學(xué)變化,成為制作減數(shù)分裂標(biāo)本首先需要考慮的重點(diǎn)問題。常規(guī)制作的減數(shù)分裂染色體標(biāo)本普遍存在分裂相細(xì)胞檢出率較低、染色體分散不良、不易識(shí)別、標(biāo)本不易保存等缺陷,在一定程度上影響了該實(shí)驗(yàn)的授課質(zhì)量和學(xué)生的觀察效率。十一酸睪酮(testosterone undercanoate, TU)是一種激素類藥物,可促進(jìn)性器官發(fā)育及睪丸生殖細(xì)胞分裂[4]。本研究采用十一酸睪酮與秋水仙素聯(lián)合應(yīng)用的方法制作減數(shù)分裂染色體標(biāo)本,并在低滲溶液的選擇和應(yīng)用,封片劑的選擇等方面加以改進(jìn),取得了令人滿意的效果,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

十一酸睪酮購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司；秋水仙素購(gòu)自上海阿拉丁科技有限公司；Giemsa、甲醇、冰醋酸等均購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 模型建立與分組

6～8周齡雄性昆明種小鼠8只,18～20g。適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后,隨機(jī)分為4組,包括對(duì)照組和低、中、高劑量模型組,每組2只。各模型組分別予以肌肉注射500、750、1000mg/kg十一酸睪酮,對(duì)照組注射相應(yīng)劑量生理鹽水。繼續(xù)喂養(yǎng)48h后,各組小鼠均腹腔注射秋水仙素2mg/kg。2h后,頸椎脫臼處死小鼠,剖開腹腔,迅速分離雙側(cè)睪丸,用于生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前期Ⅰ染色體標(biāo)本制作。

1.3 生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前期Ⅰ染色體標(biāo)本制作

將分離的小鼠睪丸放入盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中清洗,用解剖探針剝?nèi)ゲG丸被膜及脂肪組織,取出富含生精細(xì)胞的生精小管,移入預(yù)置0.07mol/L KCl低滲溶液的表面皿內(nèi)。采用眼科鑷子將曲細(xì)精管分離成線狀,再用眼科剪將精細(xì)小管剪碎,吸入離心管中,37℃孵育20min。吸棄上清,加入甲醇冰醋酸固定液,定容至10ml。室溫下固定20min后,800r/min,離心8min。再次吸棄上清,加入60%冰乙酸3ml軟化曲細(xì)精管。用吸管輕柔吹打使之融化,再次加入新配制的甲醇冰醋酸固定液,定容至10ml。800r/min,離心8min,富集生精細(xì)胞。吸棄上清,加入1ml甲醇冰醋酸固定液吹打均勻。取預(yù)置0℃的凈化玻片,從20cm 高處垂直滴加上述細(xì)胞處理液置玻片上,每張玻片滴加2滴。將玻片移至乙醇燈上快速干燥。Giemsa染液(pH=7.2)染色8min,水洗晾干,無水乙醇脫水,香柏油封片。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)生精細(xì)胞減數(shù)分裂前期I染色體細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期及終變期等各時(shí)期分裂相細(xì)胞進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)。每組觀察6張玻片,每張玻片觀察5個(gè)視野,依據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算各分裂相細(xì)胞的檢出率。檢出率(%)=每視野分裂相細(xì)胞數(shù)/每視野細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示,各干預(yù)組分裂相細(xì)胞明顯增多,且分布均勻,染色體結(jié)構(gòu)緊湊,背景清晰,與對(duì)照組比較,均有較大改善。進(jìn)一步的細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,對(duì)照組非分裂細(xì)胞達(dá)到55.63%,而500、750、1000mg/kg十一酸睪酮干預(yù)組隨著十一酸睪酮的應(yīng)用及其劑量的提高,其非分裂細(xì)胞所占比例逐漸降低,分別較對(duì)照組顯著減少了9.71%、20.58% 和26.64%(P<0.05),其中,750、1000mg/kg十一酸睪酮組與500mg/kg十一酸睪酮組比較,非分裂細(xì)胞亦明顯減少,而750mg/kg與1000mg/kg十一酸睪酮組之間比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分裂各期細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,750mg/kg十一酸睪酮組偶線期細(xì)胞達(dá)到22.05%,分別較對(duì)照組和500mg/kg十一酸睪酮組增多4.84%和4.70%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；500、750、1000mg/kg十一酸睪酮組粗線期細(xì)胞較對(duì)照組分別增多了10.74%、14.73%和20.09%,其中,1000mg/kg十一酸睪酮組較500mg/kg十一酸睪酮組明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組間細(xì)線期、雙線期及終變期細(xì)胞差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1,圖1)。

表1 各組小鼠生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前期I染色體分裂相計(jì)數(shù)結(jié)果

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vs500mg/kg testosterone undercanoate group

圖1 光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前期Ⅰ染色體分裂相，Giemsa,×400

3 討論

減數(shù)分裂是進(jìn)行有性生殖的生物在形成成熟生殖細(xì)胞的過程中所特有的細(xì)胞分裂方式,染色體數(shù)目減半和重新組合是其主要特征[5]。減數(shù)分裂異?？蓪?dǎo)致人類許多遺傳性疾病的發(fā)生,如唐氏綜合征(DS)[1]、18-三體綜合征[2]、克氏綜合征等當(dāng)今世界范圍內(nèi)發(fā)生率較高的新生兒染色體異常疾病,即是由于生殖細(xì)胞在進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)染色體不能正常分離或染色體額外復(fù)制所致。這種不可逆性的新生兒出生缺陷為社會(huì)和家庭均造成極大的精神痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。因此,闡明減數(shù)分裂的機(jī)制及分裂異常發(fā)生機(jī)制就顯得十分重要。目前,醫(yī)學(xué)院校普遍將減數(shù)分裂染色體形態(tài)學(xué)觀察作為醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)課程對(duì)本科生進(jìn)行重點(diǎn)教授[1],減數(shù)分裂染色體標(biāo)本的制作質(zhì)量也成為制約該實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果的關(guān)鍵因素。

減數(shù)分裂的特殊過程主要發(fā)生在第1次減數(shù)分裂的前期,即前期Ⅰ。根據(jù)染色體形態(tài)特點(diǎn)通常分為5個(gè)時(shí)期： 細(xì)線期；偶線期；粗線期；雙線期；終變期)[5]。由于減數(shù)分裂前期I各階段獨(dú)特的分裂相變化,一般選擇這一時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行染色體標(biāo)本制作,供本科生觀察學(xué)習(xí)。本科生上課時(shí)間有限,因此,滿足本科生實(shí)驗(yàn)課需求的減數(shù)分裂染色體標(biāo)本應(yīng)具備以下幾方面的條件： (1) 染色體結(jié)構(gòu)清晰,無重疊,易于觀察；(2) 標(biāo)本中有較高比例的分裂相細(xì)胞；(3) 5個(gè)時(shí)期的分裂相細(xì)胞均應(yīng)保持較高的檢出率,以方便學(xué)生在有限的時(shí)間內(nèi)對(duì)每個(gè)時(shí)期的分裂相細(xì)胞進(jìn)行查找和觀察。然而,常規(guī)方法制作的生殖細(xì)胞減數(shù)分裂標(biāo)本非分裂相細(xì)胞數(shù)目較多、分裂相細(xì)胞檢出率較低、細(xì)胞染色體堆積,不易辨別,觀察效果并不理想。同時(shí),常規(guī)方法制作的染色體標(biāo)本細(xì)線期、偶線期和粗線期細(xì)胞較多,雙線和終變期細(xì)胞則幾乎不可見,且染色體輪廓不清晰、結(jié)構(gòu)模糊,影響了學(xué)生對(duì)染色體分裂相的觀察質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)采用肌肉注射十一酸睪酮聯(lián)合秋水仙素腹腔注射的方法制作小鼠生殖細(xì)胞減數(shù)分裂染色體標(biāo)本,以期獲得理想的觀察效果。十一酸睪酮是一種激素類藥物,可促進(jìn)性器官發(fā)育及睪丸生殖細(xì)胞分裂和成熟；而秋水仙素的作用主要是是破壞紡錘體微管,以獲得更多的分裂相細(xì)胞[7]。本實(shí)驗(yàn)將十一酸睪酮促進(jìn)生殖細(xì)胞分裂的特性應(yīng)用到小鼠生殖細(xì)胞減數(shù)分裂染色體標(biāo)本的制作過程中,提前48h對(duì)小鼠進(jìn)行十一酸睪酮干預(yù)處理,以增加生精細(xì)胞分裂相的比例；然后再結(jié)合秋水仙素作用小鼠2h,分離小鼠睪丸生精小管中生精細(xì)胞,進(jìn)行減數(shù)分裂前期I各階段染色體形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果證實(shí),采用肌肉注射十一酸睪酮聯(lián)合秋水仙素腹腔注射的方法制作的生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前期I染色體標(biāo)本,染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚,背景清晰,觀察效果良好,且獲得的染色體分裂相細(xì)胞較常規(guī)制片方法顯著增多,其中粗線期細(xì)胞在各劑量十一酸睪酮組均表現(xiàn)出良好的檢出率,同時(shí),雙線期和終變期細(xì)胞檢出率也分別從0.16%上升為0.54%和0.92%,即平均觀察2～3張玻片即有該分裂相細(xì)胞檢出,而對(duì)照組則需要觀察5～6張玻片才能觀察到雙線期和終變期細(xì)胞,這顯著提高了學(xué)生的觀察效率及該項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量。對(duì)于十一酸睪酮最適劑量的選擇,本研究認(rèn)為,750、1000mg/kg 十一酸睪酮干預(yù)組染色體標(biāo)本觀察效果與500mg/kg十一酸睪酮干預(yù)組有較大差別,而750mg/kg 與1000mg/kg十一酸睪酮干預(yù)組之間無差異,因此將750mg/kg十一酸睪酮作為生殖細(xì)胞減數(shù)分裂染色體標(biāo)本制作最適劑量。

在減數(shù)分裂標(biāo)本制作過程中,本實(shí)驗(yàn)除了引入十一酸睪酮促進(jìn)生殖細(xì)胞分裂外,對(duì)低滲溶液處理時(shí)間及封片技術(shù)也做了相應(yīng)改進(jìn)。低滲溶液的處理環(huán)節(jié)對(duì)標(biāo)本質(zhì)量具有重要影響。低滲過度易造成細(xì)胞破裂,低滲不足則會(huì)使染色體分散不良,不易觀察。常規(guī)制作減數(shù)分裂標(biāo)本時(shí),多采用低滲處理30min的方法,效果不甚理想。本實(shí)驗(yàn)采用0.07mol/L KCl溶液,同時(shí)將低滲處理時(shí)間縮短為20min,可見生精小管細(xì)胞可充分吸收水分,適度膨脹但又未達(dá)到細(xì)胞破裂的程度。這種方法可使染色體不易裂解分散,便于染色觀察。此外,常規(guī)標(biāo)本制作過程中常采用中性樹膠封片,這種方法易使標(biāo)本被二甲苯氧化呈酸性而褪色。本實(shí)驗(yàn)采用香柏油封片技術(shù),不僅避免了在顯微鏡觀察過程中玻片標(biāo)本出現(xiàn)劃痕等問題,還可使標(biāo)本重復(fù)使用5年不褪色,大大提高了標(biāo)本的使用時(shí)間。

綜上所述,采用肌注十一酸睪酮與秋水仙素聯(lián)合應(yīng)用的方法制作減數(shù)分裂標(biāo)本,可顯著提高生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前期I染色體標(biāo)本的制作質(zhì)量和觀察效果,對(duì)增強(qiáng)醫(yī)學(xué)生業(yè)務(wù)技能,做好染色體病產(chǎn)前診斷和篩查,減少出生缺陷,提高出生人口素質(zhì),具有重要意義,值得廣泛推廣應(yīng)用。