東鄉(xiāng)族視黃醇結(jié)合蛋白4基因位點(diǎn)多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性分析?

楊雨旸 常 青 高靜媛△ 張 放 梁芳倩 劉 靜

(華北理工大學(xué), 1 中醫(yī)學(xué)院, 2 附屬醫(yī)院老年病科, 唐山 063000； 3 甘肅省人民醫(yī)院, 蘭州 730000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種受多基因影響的代謝性疾病,其患病率呈逐年上升趨勢[1],成為21 世紀(jì)威脅人類健康最重要的慢性非傳染性疾病之一[2]。在我國,東鄉(xiāng)族是甘肅省特有的少數(shù)民族,是糖尿病高發(fā)民族[3],且保持有純化程度比較高的遺傳特性[4]。視黃醇結(jié)合蛋白4(retibol-binding protein 4, RBP4)是糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與胰島素抵抗及胰島素分泌密切相關(guān),其遺傳變異可能是評估2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)的重要因素。對于不同的種族,RBP4基因的遺傳易感性不同,因此本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)?變性高效液相色譜(polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography, PCR-DHPLC)和DNA測序技術(shù)相結(jié)合對甘肅省東鄉(xiāng)族人群2型糖尿病群體RBP4基因的rs17484721和rs36035572位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行篩查和測序分析,探討RBP4基因多態(tài)性與東鄉(xiāng)族人群2型糖尿病的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機(jī)選取甘肅省臨夏自治州東鄉(xiāng)族2型糖尿病患者107例,其中男74例,女33例,平均年齡(53.65±9.73)歲及同期115例健康體檢人群,其中男80例,女35例,平均年齡(51.83±9.10)歲。分別設(shè)為Ⅱ型糖尿病組和對照組。彼此間無血緣關(guān)系。均排除吸煙嗜酒者；排除高血壓、冠心病以及肝、腎疾病；排除1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病等。2型糖尿病診斷按照2005年世界衛(wèi)生組織規(guī)定的診斷標(biāo)準(zhǔn),空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)≧7.0mmol/L和(或)口服葡萄糖耐量(OGTT) 2h血糖≧11.1mmol/L。患者均簽署知情同意。

1.2 臨床數(shù)據(jù)及生化指標(biāo)檢測

按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),采取面對面問卷調(diào)查詢問,測量受試者身高、體質(zhì)量(body mass index, BMI)、收縮壓(systolic blood pressure, SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)。抽取受試者清晨空腹靜脈血10ml,5ml EDTA抗凝用于DNA提取,其余5ml用于檢測空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)；空腹血漿胰島素(fasting plasma insulin, FPI)；胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index, HOMA-IR)；血清總膽固醇(total cholesterol, TC)；血清甘油三酯(triglyceride, TG)；高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)； 低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)。

1.3 分子生物學(xué)檢測

1.3.1 基因組DNA提取 取靜脈血5ml與EDTA抗凝,SDS-蛋白酶K消化蛋白質(zhì)及肽類,用苯酚-氯仿法萃取法除蛋白,多糖,酚類等雜質(zhì),再加入乙醇沉淀即可使核酸分離,提取DNA后,溶于TE緩沖液,置-20℃冰箱保存以備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 參照NCBI GenBank中nt_030059序列用Primer 5軟件設(shè)計(jì)RBP4基因第5內(nèi)含子區(qū)PCR擴(kuò)增特異性引物,正向引物5′-agggtgccttctggctc ttc-3′和反向引物5′-ctttactgggctgctcaatc-3′。PCR條件如下： 95℃預(yù)變性1分鐘,95℃ 30s下進(jìn)行30次變性,56℃退火30s,72℃處延長40s,72℃延長10min。然后以0.01℃/s的速度緩慢降至45℃,使之充分形成雜合雙鏈。產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后待檢測。

1.3.3 變性高效液相色譜分析 將產(chǎn)物置于WAVE的DNA片段分析系統(tǒng)(Transgenomic公司)的96孔板上,根據(jù)解鏈曲線,利用DHPLC檢測儀和WAVE-Maker 4.1軟件選出全部擴(kuò)增片段的最適檢測溫度(60.5℃)和分離梯度。取6μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自動上樣至DNA分離柱,用緩沖液A[pH7.0,0.1mmol/L三乙胺乙酸鹽(TEAA),0.1mmol/L EDTA]、緩沖液B(pH 7.0,0.1mmol/L TEAA中含25%的乙腈)以0.9ml/min 的流速進(jìn)行洗脫。被分離柱洗脫的異源雙鏈DNA溶液用吸收峰為OD 260nm波長紫外檢測儀檢測。

1.3.4 DNA測序 DHPLC檢測后再在色譜圖中顯示為峰的數(shù)目和寬度異常的PCR產(chǎn)物在自動ABI 3730遺傳基因分析儀上進(jìn)行核苷酸序列測定(上海生工測序有限公司)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組人群一般情況比較

結(jié)果如表1所示,東鄉(xiāng)族受試者2型糖尿病組人群WHR、FPG、HOMA-IR、SBP較對照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。

表1 東鄉(xiāng)族所有受試者的臨床數(shù)據(jù)特征比較

BMI： body mass index; WHR： waist hip ratio; FPG： fasting plasma glucose; FPI： fasting plasma insulin; HOMA-IR： insulin resistance index; SBP： systolic blood pressure; DBP： diastolic blood pressure;*P<0.05vscontrol group

2.2 PCR-DHPLC篩查

DHPLC法分析表明RBP4第5內(nèi)含子片段中存在兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)(rs17484721和rs36035572位點(diǎn)),且每個(gè)SNP有兩個(gè)等位基因(分別為rs17484721的T/C等位基因和rs36035572的 I/D等位基因)和3種基因型(rs17484721的TT、TC和CC基因型和 rs36035572的II 、ID和 DD基因型)。2個(gè)位點(diǎn)的突變存在強(qiáng)連鎖不平衡,并且兩者的等位基因頻率均小于5%。本實(shí)驗(yàn)得出3個(gè)色譜(圖1)： 147例野生型(圖1A),71例為雜合子突變(圖1C)和4例純合突變(圖1B)。DNA測序分析表明,這2個(gè)單核苷酸多態(tài)性的變化總是同時(shí)發(fā)生的,當(dāng)rs17484721是T等位基因時(shí),rs36035572會插入I突變基因；當(dāng)檢測rs17484721是C等位基因,在rs36035572會缺失D突變基因。DNA測序分析的結(jié)果如圖2所示。

圖1 DHPLC檢測RBP4基因PCR產(chǎn)物的色譜圖。A： 無突變患者色譜圖；B： 純合突變攜帶者色譜圖；C： 雜合突變攜帶者色譜圖.

圖2 DNA序列分析結(jié)果。左邊是rs17484721；右邊是rs36035572。這2個(gè)位點(diǎn)之間的距離68bp。I代表T變異；D表示因rs36035572變異所失去的T。A： 雜合子變異與T/C和I/D序列；B： 沒有任何突變的序列；C： 純合子變異C/C和D/D序列.

Fig 1 Chromaotgraphic WAVE pattern by DHPLC for the RBP4 PCR products. A： DHPLC chromatogram of the carriers without mutation; B： DHPLC chromatogram of the carriers with homozygous mutation; C： DHPLC chromatogram of the carriers with heterozygous mutation.

Fig 2 The result of DNA sequence analysis. On the left is rs17484721; on the right is rs36035572. The distance between the two SNPs is 68bp. I represented the inserted variation of T; D represents T at rs36035572 that was lost due to mutation. A： Heterozygous variant with T/C and I/D; B： Sequence without any mutation; C： Homozygous variant with C/C and D/D.

2.3 等位基因和基因型頻率的比較

測試所有受試者基因型的遺傳變異,基因型頻率分布符合哈迪-溫伯格遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg quilibrium),即： 2型糖尿病PH-W=0.962；對照組PH-W=0.662。顯示T和I等位基因頻率為82.2%,C和D等位基因頻率為17.8%。觀察到的2個(gè)SNPs的基因型頻率的不偏離。2型糖尿病組的TT和Ⅱ 2個(gè)基因型的頻率較對照組顯著增高(P<0.05)；2型糖尿病組的等位基因T等位基因頻率較高,C等位基因和D等位基因較對照組降低(P<0.05)?；蛐秃偷任换蝾l率數(shù)據(jù)見表2。

*P<0.05vscontrol

2.4 單體型對照分析

由2個(gè)SNPs構(gòu)建的2型糖尿病患者中的單體型基因(T/T-I/I or C/C-D/D)與對照組相比,T/T-I/I單體型較高和C/C-D/D單體型顯著降低,即在2型糖尿病患者中,T、I等位基因頻率較高,C、D等位基因頻率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。評估緊密連鎖不平衡(LD)區(qū)域,具有較強(qiáng)的成對連鎖不平衡(D>0.9,R2>0.9)(表3)。

*P<0.05vscontrol

2.5 基因型臨床特征分析

按單體型分組,本次實(shí)驗(yàn)檢測東鄉(xiāng)族所有受試者的臨床指標(biāo),顯示不同的基因型與血清甘油三酯(TG)之間存在關(guān)聯(lián)。在TG水平上,2型糖尿病組中TT+Ⅱ基因型顯著高于TC+CC和ID+DD基因型(P<0.05)；對照組中TT+Ⅱ基因型顯著高于TC+CC和ID+DD基因型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 東鄉(xiāng)族不同基因型的臨床指標(biāo)比較

BMI： body mass index; WHR： waist hip ratio; FPG： fasting plasma glucose; FPI： fasting plasma insulin; HOMA-IR： insulin resistance index; SBP： systolic blood pressure; DBP： diastolic blood pressure; TC： totalcholesterol; TG： triglyceride; HDL-C： high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C： low-density lipoprotein cholesterol;*P<0.05vsTT/Ⅱ group

3 討論

目前,2型糖尿病受到越來越多的關(guān)注,它是一種多源性病因所引起的疾病,主要受遺傳因素、社會因素、生活方式及環(huán)境因素等綜合影響,而這些因素是2型糖尿病的高危發(fā)病因素[5]。本次研究對象選取基因純合性較高的東鄉(xiāng)族人群,由于東鄉(xiāng)族人群的飲食習(xí)慣主要是高糖高脂,多以從事體力勞動,對疾病認(rèn)知不足,地處偏遠(yuǎn)且經(jīng)濟(jì)文化落后,這可能是高發(fā)2型糖尿病的主要因素[6]。2型糖尿病其發(fā)病機(jī)制主要是胰島素抵抗。RBP4是近幾年研究比較熱門的易感基因,臨床研究表明升高血清中RBP4水平可增加代謝性疾病的發(fā)病率,包括肥胖、胰島素抵抗、心血管疾病、2型糖尿病[7-8]。且流行病學(xué)研究表明,人體循環(huán)中RBP4水平的升高會標(biāo)志著這些疾病的發(fā)生[9]。有動物實(shí)驗(yàn)表明,升高小鼠RBP4基因的mRNA表達(dá)水平可發(fā)生胰島素抵抗,而降低RBP4基因mRNA表達(dá)水平則提高胰島素敏感性[10]。RBP4基因非編碼區(qū)SNP位點(diǎn)可能引起胰島素抵抗,并參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展[11-12],其原因可能是RBP4通過阻斷抗原呈遞和T細(xì)胞活化從而誘導(dǎo)的胰島素抵抗[10-13]。本研究選取東鄉(xiāng)族人群作為研究對象,DHPLC法分析表明RBP4第5內(nèi)含子片段中存在兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)(rs17484721和rs36035572位點(diǎn)),且每個(gè)SNP有兩個(gè)等位基因(分別為rs17484721的T/C等位基因和rs36035572的 I/D等位基因)和3種基因型(rs17484721的TT、TC和CC基因型和 rs36035572的II 、ID和 DD基因型)。DNA測序分析表明,rs17484721和rs36035572處于連鎖不平衡(LD)區(qū)域,具有較強(qiáng)的成對連鎖不平衡。

測試所有受試者基因型的遺傳變異,其基因型頻率分析結(jié)果表明,相比其他位點(diǎn)的基因型,在2型糖尿病組中,rs17484721位點(diǎn)的TT基因型頻率明顯增高,rs36035572位點(diǎn)的Ⅱ基因型頻率也明顯增高,說明相對于攜帶其他基因型的人,攜帶有TT基因型和(或)Ⅱ基因型的人更易患2型糖尿?。磺覙?gòu)建的單體型模型表明,2型糖尿病組中的單體型基因中,T/T-I/I單體型較對照組顯著增高；C/C-D/D單體型較對照組顯著降低,即在2型糖尿病患者中T、I等位基因頻率較高,C、D等位基因頻率降低,說明單體型TT-II可能與2型糖尿病具有相關(guān)性,并且可能是2型糖尿病的易患多態(tài)位點(diǎn)。rs17484721和rs36035572位于RBP-4 基因密集LD 區(qū)域,此區(qū)域包括RBP4下游基因G 蛋白偶聯(lián)受體120基因(GPR120)的部分序列。GPR120基因在體內(nèi)分布廣泛[14],分別是通過激活GPR120偶聯(lián)G蛋白(Gq/11)或β-抑制蛋白這兩條途徑來促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌、促進(jìn)GLP-1 釋放、抗炎等,目的是改善對2型糖尿病的體內(nèi)代謝狀態(tài)[15-16]。因此,可推測rs17484721位點(diǎn)的TT基因型頻率和rs36035572位點(diǎn)的Ⅱ基因型頻率的增高可能引起了GPR120在mRNA水平上的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上的翻譯,進(jìn)一步說明,基因型頻率的變異可能與2型糖尿病的發(fā)病率有相關(guān)性。

膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一方面是胰島素敏感的靶組織的主要胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,另一方面有助于細(xì)胞對葡萄糖的吸收[17]。它的缺陷是胰島素抵抗的一個(gè)早期特征[18]。研究表明[20]RBP 4血清水平的升高能夠通過抑制肌肉中的胰島素信號通路和增加肝糖輸出而增加胰島素抵抗,并且RBP4-GLUT4系統(tǒng)可改善2型糖尿病癥狀。有研究采用logistic回歸和Cox回歸分析確定視黃醇暴露水平對2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的影響[20-21]。說明RBP4-GLUT4系統(tǒng)與2型糖尿病存在一定的關(guān)聯(lián)性。

本研究分析了脂代謝紊亂與2型糖尿病的基因易感性之間的關(guān)系,顯示在TG水平上,2型糖尿病組和對照組中TT+II基因型顯著高于TC+CC和ID+DD基因型,因此表明,TG水平的高低與東鄉(xiāng)族2型糖尿病的rs17484721和rs36035572多態(tài)性具有相關(guān)性。本研究還顯示兩組TT-II基因型的HOMA-IR水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此可以增大樣本量,減小誤差,進(jìn)行深層次的研究和證實(shí)。

總之, RBP4基因變異可能與東鄉(xiāng)族人2型糖尿病和血清甘油三酯水平有關(guān)。rs17484721和rs36035572基因多態(tài)性參與東鄉(xiāng)族2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),它們的變化與東鄉(xiāng)族人群血清甘油三酯水平相關(guān)。本次研究由于東鄉(xiāng)族總?cè)丝跀?shù)較少,樣本量相對較少,及因2型糖尿病是多基因遺傳性疾病,而且每個(gè)易感基因功能不同且作用微效,因此應(yīng)該進(jìn)行多基因綜合檢測,以后應(yīng)在這兩方面進(jìn)行深入研究。