CUG連接蛋白1在胃癌組織中的表達及對SGC7901細胞增殖和侵襲能力的影響

朱 倩，桂芬芳，羅子華，吳京華，黎發(fā)明，鄭建偉

1)深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院消化內科 廣東深圳 518110 2)華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院普外科 武漢 430030

胃癌作為消化系統(tǒng)高發(fā)惡性腫瘤，具有較高的病死率。近年來隨著診療技術的進步，胃癌預后得到一定改善，但進展期患者依然生存率較低[1]。研究[2-3]表明，早期轉移是影響胃癌預后的主要因素。因此，積極探討影響胃癌侵襲轉移的相關因素對改善預后具有重要意義。CUG連接蛋白1(CUG-binding protein 1，CUGBP1)作為一種RNA連接蛋白家族成員，在mRNA翻譯及降解中發(fā)揮重要作用，與胚胎發(fā)育、組織形成、細胞分化關系密切[4]。近年來研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，CUGBP1在多種腫瘤組織中表達異常，可能與腫瘤發(fā)生關系密切。本研究分析了胃癌組織中CUGBP1蛋白的表達；通過RNA干擾技術沉默人胃癌SGC7901細胞中CUGBP1基因，觀察細胞生物學特性的改變；以期為胃癌侵襲轉移機制的研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1胃癌組織中CUGBP1蛋白表達的檢測

1.1.1 臨床資料 組織標本來源于2014年2月至2017年3月在深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院擇期行根治性手術治療的胃癌患者，均經病理學檢查確診，共82例，患者術前均未接受放化療。其中，男45例，女37例，年齡40～74歲，≥60歲52例；腫瘤直徑≥5 cm17例；組織分型：腸型53例，彌漫型29例；分化程度：低分化26例，中高分化56例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲ、Ⅳ期44例；浸潤深度：T1有13例，T2、T3共69例；發(fā)生淋巴結轉移45例。術中留取癌組織及距癌灶邊緣>5 cm并經病理學檢查證實的正常組織，福爾馬林固定，石蠟包埋保存。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.1.2 CUGBP1蛋白表達的檢測 EnVision二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司，一抗兔抗人CUGBP1多克隆抗體購自美國Abcam公司。取石蠟標本，切片，用二甲苯和梯度乙醇脫水，用過氧化氫除去內源性過氧化物酶，用檸檬酸鹽(pH 6.0)行高壓抗原修復，按照試劑盒說明完成檢測。一抗稀釋度1∶500。DAB顯色，蘇木精復染，封片，透明，鏡下觀察。胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物質為陽性細胞。高倍鏡下選取5個視野，根據(jù)染色強度和陽性細胞比例進行結果判定[8]：無染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色染色分別計為0、1、2、3分；無陽性細胞，陽性細胞比例<10%、10%～、51%～、>75%分別計為0、1、2、3、4分；兩項計分相乘，0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.2沉默CUGBP1基因后SGC7901細胞生物學特性的觀察

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組 SGC7901細胞購自中科院上海細胞生物學研究所。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。將SGC7901細胞置于含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在含體積分數(shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，2.5 g/L胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗分3組，空白對照組、對照siRNA組和CUGBP1 siRNA組。CUGBP1 siRNA組、對照siRNA組用Lipofectamine2000轉染試劑盒(美國Invitrogen公司)分別轉染 CUGBP1 siRNA(序列5’-CTAGCCGGGATTGAAGAATGCCGGATATTCAAGAGATATCCGGCATTCTTCAATCTTTTTAAT-3’)和對照siRNA序列(5’-CTAGCCCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTATCTCGAGATACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTTAAT-3’)，空白對照組不作任何處理。siRNA由上海銳賽生物技術公司設計合成。

1.2.2 細胞中CUGBP1 mRNA的檢測 Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉錄及熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程公司，PCR儀購自美國Bio-Rad公司，CUGBP1和內參GAPDH引物由上海生工生物工程公司設計合成。轉染48 h后收集細胞，加入細胞裂解液，提取總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。CUGBP1上游引物序列：5’-GATCAGTGCAGCGTCTGTGT-3’，下游：5’-GTGTTGAGGTTCCCAGAGGA-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游：5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)40次。每組設3個平行孔。用2-ΔΔCt法計算CUGBP1 mRNA的相對表達量。

1.2.3 細胞增殖能力的檢測 MTT細胞增殖檢測試劑盒購自上海威奧生物科技公司。取轉染48 h后的各組細胞，胰蛋白酶消化，接種于96孔板，密度1×104個/孔，在含體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于12、24、48、72和96 h時，將10 μL的MTT液加入各孔，培養(yǎng)4 h后加入100 μL的二甲基亞砜，充分振蕩，用酶標儀于490 nm波長處檢測吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.2.4 細胞遷移和侵襲能力的檢測 ①劃痕實驗：在6孔板背面劃橫線，每孔5條平行線。取各組轉染48 h后的細胞，常規(guī)胰蛋白酶消化后接種于6孔板，每組6個復孔。待細胞長滿孔底時，用200 μL槍頭垂直于孔板底部從上而下劃線，槍頭要垂直，不能傾斜，盡量保證各個劃痕寬度一致，去除舊培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，分別于培養(yǎng)0、24和48 h時拍照，利用Image-Pro Plus軟件測量劃痕寬度。劃痕修復率=(0 h時劃痕寬度-24 h或48 h時劃痕寬度)/0 h時劃痕寬度×100%。②Transwell實驗：Transwell小室和Matrigel膠購自美國Falcon公司。取各組轉染48 h后的細胞，胰蛋白酶消化，室溫條件下離心后留取細胞沉淀，用含體積分數(shù)1%胎牛血清的無血清培養(yǎng)液制備單細胞懸液，密度為1×105mL-1。取100 μL細胞懸液加入Transwell小室上室，將600 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液加入下室，在含體積分數(shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用甲醛固定細胞，結晶紫染色，用棉簽輕輕除去散落細胞，拍照，取5個高倍視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)，即為遷移細胞數(shù)。實驗重復3次。將Matrigel膠平鋪于Transwell小室，4 ℃風干備用，其余步驟同前，檢測侵襲細胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計學處理使用SPSS 21.0完成數(shù)據(jù)分析。癌及癌旁正常組織中CUGBP1蛋白陽性表達率的比較采用配對χ2檢驗；不同臨床病理特征胃癌組織中CUGBP1蛋白陽性表達率的比較采用成組資料的χ2檢驗；3組細胞A值、劃痕修復率、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1胃癌組織中CUGBP1蛋白的表達胃癌及癌旁正常組織中CUGBP1蛋白的表達見圖1、表1。

圖1 胃癌(A)和癌旁正常組織(B)中CUGBP1蛋白的表達(EnVision，×400)

表1胃癌和癌旁正常組織中CUGBP1蛋白表達的比較例

癌旁正常組織胃癌組織陽性陰性合計陽性251439陰性38543合計631982

χ2=11.077,P=0.001

胃癌組織中CUGBP1蛋白陽性表達率達76.8%，高于癌旁正常組織(47.6%)。不同臨床病

理特征胃癌組織中CUGBP1蛋白表達的比較見表2。低分化、TNM分期為Ⅲ和Ⅳ期、浸潤深度為T2和T3、有淋巴結轉移的胃癌組織中CUGBP1蛋白陽性表達率更高(P<0.05)。

表2 不同臨床病理特征胃癌組織中CUGBP1蛋白表達的比較 例(%)

2.2沉默CUGBP1基因后SGC7901細胞生物學特性的變化

2.2.1 3組細胞中CUGBP1 mRNA表達的比較 CUGBP1 siRNA組、對照siRNA組和空白對照組細胞中CUGBP1 mRNA的相對表達量分別為(1.19±0.16)、(2.14±0.11)和(2.22±0.14)，差異有統(tǒng)計學意義(F=104.472，P<0.001)，CUGBP1 siRNA組細胞中CUGBP1 mRNA相對表達量低于兩個對照組(P<0.05)。

2.2.2 3組細胞增殖能力的比較 見表3。CUGBP1 siRNA組細胞24、48、72和96 h時A值低于兩個對照組(P<0.05)。

表3 3組細胞不同時間點A值比較(n=6)

*：與CUGBP1 siRNA組比較，P<0.05

2.2.3 3組細胞遷移和侵襲能力的比較 見表4、5。CUGBP1 siRNA組24和48 h時細胞劃痕修復率均低于對照siRNA組和空白對照組(P<0.05)，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)亦低于對照siRNA組和空白對照組(P<0.05)。

表4 3組細胞劃痕修復率的比較(n=6) %

*：與CUGBP1 siRNA組比較，P<0.05

表5 3組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)的比較

*：與CUGBP1 siRNA組比較，P<0.05

3 討論

有研究[9-10]指出，腫瘤轉移、復發(fā)依然是胃癌患者死亡風險增加的主要因素，如何有效減少胃癌早期轉移及術后復發(fā)已成為目前研究的熱點和難點。CUGBP1位于人染色體11p11，與mRNA代謝密切相關[11]。楊昌俊等[12]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中CUGBP1蛋白呈高表達，并在腫瘤細胞的增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)，CUGBP1是影響非小細胞肺癌腦轉移的重要因素。本研究結果顯示，胃癌組織中CUGBP1蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織，低分化、TNM分期Ⅲ和Ⅳ期、浸潤深度T2和T3及發(fā)生淋巴結轉移的胃癌組織中CUGBP1蛋白陽性表達率明顯升高，說明CUGBP1可能參與了胃癌的發(fā)生、進展過程，可能與不良預后有關。

有研究[14]指出，CUGBP1在調節(jié)細胞生長和凋亡中起著關鍵作用。本研究結果顯示，CUGBP1 siRNA組細胞24、48、72和96 h時A值均低于對照siRNA組和空白對照組，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)亦低于兩對照組，說明CUGBP1基因與胃癌細胞的增殖、遷移能力關系密切，與Zhao等[15]和Liu等[16]的研究結論相同。

綜上所述，胃癌組織中CUGBP1蛋白呈高表達，且參與了胃癌細胞增殖、侵襲過程的調節(jié)，有望成為胃癌基因靶向治療的新靶位。