同位素質(zhì)譜儀測(cè)定小麥植株各器官δ15N值的考察

谷淑波，宋雪皎，王樹蕓，高居榮

(農(nóng)業(yè)部作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 泰安 271018)

氮素是影響小麥(Triticumaestivum)產(chǎn)量的重要礦質(zhì)元素，不僅是蛋白質(zhì)、核酸、磷脂的主要成分，還是某些植物激素、維生素和葉綠素的成分，氮的含量會(huì)直接影響細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)[1]. 為了提高小麥的產(chǎn)量，人們?cè)谛←湻N植過(guò)程中大量施入氮肥. 由于氮肥活性強(qiáng)，施入土壤經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后，除被作物吸收和土壤固持外，相當(dāng)部分氮通過(guò)氨揮發(fā)、硝化、反硝化、徑流和淋溶等途徑損失，氮素利用率明顯偏低[2-4]，并造成地下水體污染[5].

適量施入氮肥是小麥獲得高產(chǎn)的必要途徑，不同的施肥時(shí)期、施肥量和施肥方法均會(huì)影響小麥的品質(zhì)和產(chǎn)量[6-7]，因此，在盡可能地提高小麥優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的同時(shí)，還必須促進(jìn)氮素向籽粒中的運(yùn)轉(zhuǎn)，提高氮素在籽粒中的分配比例. 定量化地研究小麥在整個(gè)生育期內(nèi)吸收運(yùn)轉(zhuǎn)氮素，從整體水平上把握植物體的氮素營(yíng)養(yǎng)動(dòng)態(tài)，穩(wěn)定性同位素15N示蹤技術(shù)被認(rèn)為是一種有效的手段[8-9]. 由于15N是一種穩(wěn)定性同位素，無(wú)放射性，因而存在于自然界而無(wú)輻射污染. 已有文獻(xiàn)通過(guò)測(cè)定天然氮同位素研究原油氮沉積環(huán)境[10-11]、城市湖泊沉積物[12-13]、氣候變化[14]、小麥產(chǎn)地溯源[15]、土壤N2O溯源[16]、農(nóng)業(yè)面源污染[17]等領(lǐng)域.

元素分析儀-同位素比質(zhì)譜儀(EA-IRMS)聯(lián)用技術(shù)具有樣品前處理簡(jiǎn)單、用量少、儀器操作簡(jiǎn)便、測(cè)量精度高和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，因此該技術(shù)得到了迅速發(fā)展. 之前已有許多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了未經(jīng)標(biāo)定樣品中穩(wěn)定氮同位素比值的分析和測(cè)定方法[18-19]，但檢測(cè)15N標(biāo)記后的小麥植株不同器官δ15N值的具體測(cè)試方法還未見(jiàn)報(bào)導(dǎo). 為了有效確定小麥植株對(duì)氮肥的吸收效率及在小麥各器官中的分配比例，本文建立了利用元素分析儀-同位素比質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)對(duì)大田栽培條件下15N標(biāo)記氮肥施入后采集的不同器官材料δ15N值的測(cè)試方法，優(yōu)選了儀器的最佳測(cè)試條件，完成了測(cè)定方法精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)試，確定了小麥樣品的最佳進(jìn)樣量，以期為研究小麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中氮素的運(yùn)轉(zhuǎn)吸收利用提供有效的技術(shù)支持.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀(Isoprime100，英國(guó) Isoprime公司生產(chǎn)) ；元素分析儀(vario MICRO cube，德國(guó)Elementar公司生產(chǎn))；質(zhì)譜儀軟件是Ionvantage，元素分析儀部分配有120位固體自動(dòng)進(jìn)樣器；百萬(wàn)分之一天平(ME5型，德國(guó)Sartorius公司，精度為0.01 mg)；混合球磨儀(MM400，德國(guó)Retsch公司)；錫囊6 mm×4 mm；硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(IAEA-N-2，δ15NPDB=20.343‰，國(guó)際原子能機(jī)構(gòu))；小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) OAS/Isotope(δ15N=+2.85)；鉻酸鉛、銀絲、氧化銅、高純還原銅，均購(gòu)自德國(guó)Elementar公司；高純He氣、高純O2氣和高純N2氣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99.999%(山東省臨沂宏達(dá)特氣廠)；15N-尿素( 46.6% N，10.30 %豐度，上海化工研究院生產(chǎn)).

1.2 檢測(cè)原理

1.2.1 測(cè)試過(guò)程

將粉碎過(guò)篩后的固體樣品包入錫囊稱重，再放入元素分析儀上的樣品盤內(nèi). 待儀器穩(wěn)定啟動(dòng)分析后，自動(dòng)進(jìn)樣器會(huì)將樣品送入高溫950 ℃的燃燒管內(nèi). 在燃燒管內(nèi)暫時(shí)的富氧條件下樣品和錫囊均發(fā)生融化、燃燒，燃燒產(chǎn)物隨流速恒定的載氣He氣通過(guò)氧化催化劑，氧化產(chǎn)物通過(guò)隨后的還原反應(yīng)管. 還原管中的線狀銅將氮氧化物(NO、N2O和N2O2)還原成N2，將SO3還原成SO2，并且將多余的氧氣吸收. 揮發(fā)性的鹵素化合物則被位于還原管上方的銀絲層吸收. 經(jīng)過(guò)還原管后生成的CO2、N2和SO2進(jìn)入解析附柱. 通過(guò)對(duì)解析附柱的溫度控制，先將N2氣釋放出來(lái)，然后從元素分析儀尾部進(jìn)入質(zhì)譜儀. 樣品中的氮同位素比值經(jīng)過(guò)已知組成的參考?xì)獾拿}沖峰校準(zhǔn)后最終測(cè)得δ15N值[20].δ15N值的表達(dá)式為：

(1)

式中：R樣品、R標(biāo)準(zhǔn)分別為樣品、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中15N與14N的豐度比(15N/14N).

1.2.2 測(cè)試條件

穩(wěn)定性同位素質(zhì)譜儀參考?xì)鈮毫υO(shè)為0.1 MPa，He氣流速設(shè)為10 mL/min；元素分析儀載氣He氣流速設(shè)為200 mL/min，壓力為0.13 MPa；設(shè)置加氧流速為40 mL/min，加氧時(shí)間為90 s；熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)溫度為60 ℃；解吸柱溫度為210 ℃.

1.3 樣品采樣與預(yù)處理

試驗(yàn)材料為15N微區(qū)試驗(yàn)條件下的冬小麥植株樣品，標(biāo)記方法參考文獻(xiàn)[21]，于小麥出苗后10 d，在某一微區(qū)內(nèi)用土鉆取土至標(biāo)記深度，將10 mL 溶解了15N-尿素的去離子水溶液隨PVC管注射至所需土層，再用30 mL 去離子水分3次沖洗容器及PVC管，然后將之前所取土壤按原有層次回填，輕微壓實(shí). 各個(gè)微區(qū)內(nèi)的肥料、灌水等田間管理均與大田試驗(yàn)一致. 待小麥成熟期，將植株沿地表剪斷、取樣，并將植株樣品分為籽粒、穎殼+穗軸、葉片和莖鞘4部分，70 ℃烘干至恒量，用球磨儀粉碎樣品，過(guò)150 μm 篩，即可用于稱量、上機(jī)測(cè)定.

1.4 樣品測(cè)試

1.4.1 調(diào)試儀器

儀器只有當(dāng)達(dá)到一定條件才可以正常工作，因此每次開(kāi)機(jī)預(yù)熱后，要首先檢查穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀的真空值. 當(dāng)High Vac 小于2e-11MPa，Low Vac 小于3e-6MPa時(shí)，說(shuō)明儀器達(dá)到理想水平，然后再依次進(jìn)行儀器的檢漏測(cè)試、N2峰中心掃描、系統(tǒng)背景檢查、N2參考?xì)夥€(wěn)定性和線性測(cè)試.

1.4.2 樣品分析順序

為保證測(cè)試樣品的準(zhǔn)確，在分析前準(zhǔn)備好標(biāo)準(zhǔn)樣品(STD1)一個(gè)，另取一個(gè)性質(zhì)穩(wěn)定的具有代表性的實(shí)際樣品(STD2)，把這兩個(gè)樣品作為測(cè)試過(guò)程中質(zhì)量監(jiān)控的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì). 測(cè)試時(shí)先做空白3～6個(gè)，確保整個(gè)測(cè)試系統(tǒng)背景值達(dá)到理想的程度，再測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)樣品3個(gè)，確保儀器工作狀態(tài)穩(wěn)定. 每連續(xù)測(cè)試10個(gè)樣品后插入STD1和STD2各1個(gè)，以便質(zhì)量控制，保證系統(tǒng)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性.

1.4.3 高純N2參考?xì)猞闹档男Ｕ?/p>

樣品的δ值是根據(jù)參考?xì)庖阎低茖?dǎo)出來(lái)的，因此必須首先以硫酸銨作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)高純N2參考?xì)膺M(jìn)行校正，重復(fù)測(cè)量3～5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，確保樣品測(cè)量的精度(標(biāo)準(zhǔn)偏差)小于0.15‰，根據(jù)分析結(jié)果的平均值反算出高純參考?xì)獾恼鎸?shí)δ15N值，在數(shù)據(jù)處理方法中將真實(shí)的參考?xì)猞?5N值輸入，之后樣品計(jì)算時(shí)將自動(dòng)按照此δ15N值進(jìn)行計(jì)算.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜儀條件優(yōu)化的測(cè)試

2.1.1 儀器系統(tǒng)背景優(yōu)化

儀器運(yùn)行過(guò)程中的系統(tǒng)背景對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度影響較大，如果系統(tǒng)有漏氣故障或是參考?xì)獾倪M(jìn)樣針閥不能完全關(guān)閉，使少量參考?xì)獬掷m(xù)進(jìn)入到質(zhì)譜儀中，都會(huì)造成系統(tǒng)背景升高. 因此在質(zhì)譜參考?xì)鈮毫?.1 MPa，He氣流速為10 mL/min條件下，首先對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行背景掃描，觀察各個(gè)質(zhì)量數(shù)(mass 18,28,32,40,44)的信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果如圖1所示. 由圖1可見(jiàn)，各個(gè)質(zhì)量數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度都很低，說(shuō)明儀器運(yùn)行過(guò)程中系統(tǒng)本底很低，系統(tǒng)背景正常.

圖1 EA-IRMS系統(tǒng)的背景掃描結(jié)果Fig. 1 Background scanning result of EA-IRMS system

2.1.2 峰中心掃描

時(shí)間和溫度等環(huán)境條件變化，有可能造成每個(gè)質(zhì)量數(shù)對(duì)應(yīng)的磁場(chǎng)或加速電壓發(fā)生一定的偏移. 為了保證質(zhì)譜儀離子束測(cè)量處于最優(yōu)化的狀態(tài)，必須在測(cè)試樣品前進(jìn)行峰中心掃描. 經(jīng)峰中心掃描測(cè)試，優(yōu)化加速電壓，最終確定優(yōu)化后的加速電壓為4 100 V.

2.1.3 儀器穩(wěn)定性優(yōu)化

儀器的穩(wěn)定性直接影響儀器測(cè)量的精度，EA-IRMS系統(tǒng)的穩(wěn)定性不僅受離子源極片之間的相對(duì)位置、離子源與分析管道間的相對(duì)位置、永久磁鐵和燈絲位置的影響，同時(shí)供電環(huán)境也會(huì)影響儀器的穩(wěn)定性[22]，載氣純度、儀器靈敏度等也都影響測(cè)試數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性. 在進(jìn)行樣品測(cè)定前，要保證空白樣品產(chǎn)生的峰面積已經(jīng)穩(wěn)定，但如果峰面積不穩(wěn)定則會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生很大影響. 因此連續(xù)通入10組N2標(biāo)準(zhǔn)氣進(jìn)行空白測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖2所示.

圖2 EA-IRMS系統(tǒng)的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果Fig. 2 Stability result of EA-IRMS system

由圖2可以看出，10組空白樣品產(chǎn)生的峰基本一致，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)氣N2的同位素比值29/28的平均值為0.007 414 8，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03‰，滿足儀器要求標(biāo)準(zhǔn)氣N2的同位素比值29/28的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.06‰的條件，表明儀器穩(wěn)定性可靠. 這同王政等[23]測(cè)得的0.017‰略有不同，可能是由于質(zhì)譜儀的生產(chǎn)廠家不同，儀器的離子源和電氣參數(shù)不同造成的.

2.2 儀器線性優(yōu)化

儀器的線性也影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，而離子源應(yīng)該顯示其線性特征，即測(cè)量的同位素比值不會(huì)隨信號(hào)強(qiáng)弱的不同而改變，這樣才能確保對(duì)不同樣品進(jìn)行分析時(shí)獲得可信的同位素結(jié)果. 本試驗(yàn)在進(jìn)樣前依次改變參考?xì)膺M(jìn)樣器上N2的壓力，每個(gè)參考?xì)夥宥紩?huì)產(chǎn)生不同的信號(hào)強(qiáng)度. 通過(guò)計(jì)算，主同位素信號(hào) Major 在 1e-9至 1e-8A(相當(dāng)于1.0～10.0 V )之間，測(cè)得的總體線性為0.009 ‰/nA，達(dá)到了儀器要求的線性指標(biāo)小于0.02 ‰/nA 的測(cè)定要求. 而王政等[23]的工作中，當(dāng)離子流強(qiáng)度范圍為0.5～7.5 V時(shí)，總體線性R為0.056‰，其主要原因是儀器性能不同，拉出電壓不同，致使線性結(jié)果不同，但測(cè)得的線性結(jié)果都符合儀器的測(cè)試要求.

2.3 最佳進(jìn)樣量的確定

測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與樣品進(jìn)樣量有直接的關(guān)系，稱量樣品過(guò)少則不具代表性，數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；樣品過(guò)多，則會(huì)增加測(cè)試過(guò)程中消耗的各種試劑，如高純還原銅、銀絲、高純氦氣等，提高測(cè)試成本. 因此稱取小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1、2、3、4、5 mg，分別進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，其δ15N數(shù)據(jù)結(jié)果如表1所列.

表1 不同進(jìn)樣量的δ15N值測(cè)定結(jié)果Table 1 δ15N determination results of different sample weights

從表1可以看出，進(jìn)樣量為4、5 mg時(shí)，測(cè)得樣品的平均值與標(biāo)準(zhǔn)值+2.85‰相近. 但進(jìn)樣量為4 mg時(shí)標(biāo)準(zhǔn)偏差最佳，因此確定經(jīng)15N標(biāo)記的冬小麥植株成熟期收獲的籽粒、莖鞘、葉片、穎殼4部分最佳進(jìn)樣量為4 mg，測(cè)得的小麥δ15N值的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，與前人研究中高梁樣品稱取3～5 mg相一致[18].

2.4 測(cè)試方法的準(zhǔn)確度

分別稱取IAEA-N-2、OAS和小麥籽粒、莖鞘、葉片、穎殼約4 mg進(jìn)行測(cè)定. 經(jīng)過(guò)6次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果如表2所列. IAEA-N-2、OAS和小麥籽粒、莖鞘、葉片、穎殼的測(cè)定平均值分別為20.34‰、2.82‰、1439.56‰、1149.43‰、1335.45‰、1321.60‰，穩(wěn)定氮同位素的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，測(cè)量精度良好. 其中硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)( IAEA-N-2)和小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)OAS/Isotope與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的參考值相近，說(shuō)明該測(cè)試方法滿足小麥各營(yíng)養(yǎng)器官的準(zhǔn)確度測(cè)定.

表2 EA-IRMS系統(tǒng)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品和小麥樣品δ15N的準(zhǔn)確度Table 2 Accuracy of determination of δ15N values in standard materials and wheat samples by EA-IRMS system

2.5 樣品測(cè)定

本文選取小麥苗后10 d用15N-尿素標(biāo)記處理和未標(biāo)記條件下的成熟期樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表3所列.

表3 苗后15N標(biāo)記小麥成熟期各器官及天然小麥樣品的δ15N值Table 3 δ15N values of different wheat organs at maturity of labeled wheat after seedling and natural wheat /‰

從表3可以看出，用15N-尿素標(biāo)記不同處理的樣品δ15N值范圍為2721‰～787‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.4%～11.9%之間，未經(jīng)標(biāo)記的小麥樣品δ15N值范圍為6‰～13‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.1%～0.4%之間，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度較高.15N-尿素標(biāo)記不同處理間δ15N值差異較大，同一處理間δ15N值表現(xiàn)為葉片和籽粒較高，莖鞘和穎殼較低. 這說(shuō)明元素分析儀-同位素比質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)對(duì)于測(cè)定15N標(biāo)記小麥植株各器官的δ15N值是可靠的，可以滿足小麥栽培領(lǐng)域應(yīng)用穩(wěn)定性同位素15N進(jìn)行氮素利用及分配方面的研究.

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)儀器的調(diào)試和15N標(biāo)記的小麥樣品δ15N值測(cè)試試驗(yàn)，初步建立了測(cè)定15N標(biāo)記小麥植株各器官中穩(wěn)定氮同位素的分析方法，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確. 因此，元素分析儀-同位素比質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)可以用于測(cè)定15N標(biāo)記小麥植株各器官15N值，可應(yīng)用于小麥栽培領(lǐng)域穩(wěn)定性同位素15N分析氮素在小麥體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)及利用效率方面的研究，EA-IRMS是深入研究小麥生長(zhǎng)發(fā)育的重要儀器.