響應(yīng)面法優(yōu)化海帶脫腥工藝及其色澤品質(zhì)評(píng)價(jià)

顧賽麒，唐文燕，周洪鑫，張晨超，劉 璘，周緒霞，丁玉庭*

（浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014）

海帶（Laminaria japonica）是一種生長(zhǎng)于低溫海水中的大型海生褐藻植物，其質(zhì)地脆嫩，口感良好，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種生理活性成分，具有較高的藥用保健功效，廣受消費(fèi)者青睞[1-2]。然而，新鮮海帶腥味較重（遠(yuǎn)超淡水產(chǎn)品），降低了部分消費(fèi)者對(duì)其喜好性，同時(shí)也對(duì)海帶制品的感官品質(zhì)造成了一定影響，阻礙了海帶加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。

海帶的腥味物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜，主要包括有機(jī)嗅代物或碘代物、醇類、醛類和烯酮類等[4-6]。目前，常采用物理法、化學(xué)法和生物法對(duì)海帶進(jìn)行脫腥處理[7]。物理法和化學(xué)法主要通過(guò)屏蔽、掩埋或吸收等方式降低腥味物質(zhì)濃度，而生物法脫腥的原理是：1）將小分子的腥味物質(zhì)經(jīng)微生物的合成作用轉(zhuǎn)變成為無(wú)腥味的大分子物質(zhì)；2）在微生物酶的作用下，腥味物質(zhì)分子經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)腥味成分。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，生物法的脫腥效果最好，其常用菌種有酵母菌、乳酸菌和醋酸桿菌等[7]，其中酵母菌的脫腥效果較優(yōu)。國(guó)內(nèi)外已有一些海帶脫腥加工的相關(guān)報(bào)道，祖國(guó)仁等[8]報(bào)道采用3 種不同酵母菌對(duì)裙帶菜浸提汁進(jìn)行脫腥處理，發(fā)現(xiàn)均能有效去除腥味成分。段吳勇[9]利用0.70×108CFU/g的酵母菌對(duì)海帶脫腥，發(fā)現(xiàn)在33 ℃發(fā)酵2 h時(shí)脫腥效果較好。Seo等[10]經(jīng)研究證實(shí)微生物發(fā)酵是減少海帶異味的有效手段。

在生物法脫腥過(guò)程中，若發(fā)酵條件（酵母添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間）控制不當(dāng)，一方面可導(dǎo)致脫腥效率偏低，另一方面還可能對(duì)海帶色澤造成不利影響（如綠色消失、褐色加深），分析原因：發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸類物質(zhì)（碳酸等）可使發(fā)酵液的pH值顯著下降，造成海帶中葉綠素結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞（脫除鎂離子或自身結(jié)構(gòu)完全分解）[11]。此外，若發(fā)酵溫度過(guò)高，也會(huì)對(duì)葉綠素結(jié)構(gòu)造成不利影響。綜上所述，選取適宜的發(fā)酵條件，在脫腥處理的同時(shí)盡可能保持海帶原有色澤，可顯著提高海帶加工制品質(zhì)量。然而，多數(shù)研究者在優(yōu)化海帶脫腥工藝的同時(shí)，未全面考察海帶色澤相關(guān)指標(biāo)（色差值、葉綠素含量等）的變化規(guī)律。

本實(shí)驗(yàn)選取不同工藝發(fā)酵后的海帶作為研究對(duì)象，綜合考察感官評(píng)分、pH值、色差、葉綠素含量的結(jié)果，確定各因素的較優(yōu)作用水平?；陧憫?yīng)面設(shè)計(jì)獲得海帶發(fā)酵法脫腥的最優(yōu)工藝，并進(jìn)一步分析脫腥前后海帶的揮發(fā)性風(fēng)味成分變化，旨在為海帶制品加工企業(yè)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶于2016年5月購(gòu)自山東榮成尋山集團(tuán)；釀酒高活性干酵母（貨號(hào)：E80000012） 湖北安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、氯化鈉、丙酮、無(wú)水乙醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C5～C40正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品、2,4,6-三甲基吡啶標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR2860型打漿機(jī) 德國(guó)飛利浦有限公司；220A型分析天平 瑞士Precisa儀器有限公司；YP3001N電子天平、PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司；SKY-200B恒溫振蕩搖床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；UV759紫外-可見分光光度計(jì) 上海奧普勒儀器有限公司；CQX3448色差儀 美國(guó)Hunter Lab公司；固相萃取整體捕集劑MonoTrap RCC18（簡(jiǎn)稱MTRCC18，規(guī)格2.9 mm×5 mm，孔徑1 mm） 日本GL Sciences公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 脫腥處理

酵母活化液的制備：稱取20 g葡萄糖和0.6 g NaCl加入2 000 mL蒸餾水中，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙猓谏鲜鋈芤褐蟹謩e加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g安琪酵母干粉，依次配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的酵母菌液（菌體濃度分別為7.85、8.15、8.32、8.45、8.54（lg（CFU/g））），將其置于轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫?fù)u床中，25 ℃活化20 min。

海帶脫腥工藝：稱取1 kg原料海帶，將其剪成規(guī)格為1 cm×1 cm的小塊。稱取10 g剪碎后海帶裝入250 mL具塞錐形瓶中，向其中加入100 mL酵母活化液，將錐形瓶置于恒溫?fù)u床內(nèi)，于不同溫度（24、26、28、30、32 ℃）發(fā)酵脫腥不同時(shí)間（30、60、90、120、150 min）。將脫腥后的海帶取出，以蒸餾水沖洗干凈，并用紙巾擦干表面。以上海帶一部分用于感官評(píng)定與色差測(cè)定，剩余部分在冰浴條件下打碎至均勻，用于其他指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 感官評(píng)定

參照Dooley等[12]的方法并稍作修改。召集10 名（5 男5 女，平均年齡24 歲）具有食品感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的人員組成評(píng)定小組，采用劃線法對(duì)脫腥后的海帶進(jìn)行感官評(píng)定。各評(píng)價(jià)員在一根總長(zhǎng)為10 cm的線段上進(jìn)行劃線，劃線長(zhǎng)度代表海帶樣品氣味的“可接受度”（從腥味消除與異味生成兩方面綜合評(píng)定）。將劃線長(zhǎng)度除以10 cm再乘以100，轉(zhuǎn)化后即可獲得“可接受度”的百分制分?jǐn)?shù)為受評(píng)海帶樣品的感官評(píng)分：滿分100 分，表示樣品氣味完全可以接受；0 分表示完全不能接受。評(píng)定結(jié)果以10 名評(píng)價(jià)員打分的平均值表示。

1.3.3 pH值測(cè)定

將1.3.1節(jié)中脫腥完畢的海帶發(fā)酵液以漏斗過(guò)濾，采用pH計(jì)測(cè)定濾液的pH值。

1.3.4 色差測(cè)定

參考師萱等[13]的方法。對(duì)于脫腥后的各組海帶樣品，每組隨機(jī)挑選5 塊色澤均勻、表面平整的海帶（規(guī)格1 cm×1 cm），每塊海帶上隨機(jī)選擇3 個(gè)點(diǎn)，采用色差儀測(cè)定各點(diǎn)的L*、a*、b*值，并計(jì)算其色調(diào)值Hue=arctan（b*/a*）。以原料海帶為對(duì)照樣（CK），按式（1）計(jì)算脫腥后海帶樣品與對(duì)照樣間的總色差值（ΔE*），測(cè)定結(jié)果以15 個(gè)測(cè)量點(diǎn)的平均值表示。

1.3.5 葉綠素含量測(cè)定

參考Jeffrey等[14]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取0.5 g打碎后的脫腥海帶裝入具塞試管中，向管內(nèi)加入丙酮和無(wú)水乙醇按2∶1比例配成的浸提液，充分振蕩，定容至25 mL，室溫下避光浸提24 h。待浸提完畢后，用漏斗過(guò)濾浸提液，采用分光光度計(jì)測(cè)定濾液在645 nm和663 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)公式（2）、（3）分別計(jì)算葉綠素a含量（Ca）和葉綠素b含量（Cb），并求得兩者含量之和：

式中：D為對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下的吸光度；V為葉綠素浸提液體積（25 mL）；W為加入海帶質(zhì)量（0.5 g）。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酵母添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）作為自變量，為消除不同指標(biāo)間的量綱差異，同時(shí)對(duì)感官評(píng)分與葉綠素a、b總含量指標(biāo)進(jìn)行離差標(biāo)準(zhǔn)化（min-max normalization，MMN）[15]，將兩者標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值分別乘以各自的權(quán)重系數(shù)（0.75和0.25，由學(xué)校和企業(yè)專家共同開會(huì)討論決定）后進(jìn)行加和，其和值即為綜合評(píng)分（Y），綜合評(píng)分可作為模型的因變量（響應(yīng)值），其最高分值為1 分。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（表1），對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行建模分析，以確定海帶發(fā)酵脫腥的最優(yōu)工藝。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface experimental design

1.3.7 整體材料吸附萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（monolithic material sorptive extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry，MMSE-GC-MS）測(cè)定

1.3.7.1 萃取條件

參照顧賽麒等[16]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取2.0 g打碎后的脫腥海帶，將其加入20 mL棕色頂空瓶中。選取4 個(gè)MTRCC18吸附子（空心圓柱體形狀），以固定裝置串聯(lián)后置于頂空瓶?jī)?nèi)海帶正上方。將頂空瓶置于恒溫水浴鍋中，60 ℃萃取1 h。待萃取完畢后，取下所有吸附子迅速裝入熱脫附管，再由前處理平臺(tái)將熱脫附管轉(zhuǎn)移至熱脫附器中進(jìn)行熱解吸進(jìn)樣。

1.3.7.2 儀器參數(shù)

熱脫附器條件：不分流模式，初始溫度40 ℃，以180 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。冷進(jìn)樣系統(tǒng)參數(shù)：液氮制冷，起始溫度-40 ℃，平衡30 s，以12 ℃/s升至270 ℃，保留10 min。

GC條件：DB-5 MS毛細(xì)管柱（柱長(zhǎng)60 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚1 μm），汽化室溫度240 ℃，不分流模式進(jìn)樣。起始柱溫40 ℃，以4 ℃/min升至100 ℃，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以8 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。載氣為99.999%高純氦氣，載氣流量1.0 mL/min。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，全掃描模式，無(wú)溶劑延遲，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500，掃描速率3.0 scans/s，燈絲發(fā)射電流200 μA，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃，傳輸線溫度270 ℃，檢測(cè)器電壓1.2 kV。

1.3.7.3 定性方法[17]

將測(cè)定得到的揮發(fā)物質(zhì)譜圖與NIST和Wiley（2008）標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，僅報(bào)道正反匹配度均大于800（最大值為1 000）的鑒定結(jié)果。同時(shí)計(jì)算各物質(zhì)的線性保留指數(shù)（linear retention index，LRI）并與文獻(xiàn)中的LRI值進(jìn)行比對(duì)，LRI計(jì)算見公式（4）：

式中：Rt（x）、Rt（n）及Rt（n＋1）分別表示待測(cè)揮發(fā)性成分、含n 個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴及含（n＋1）個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

1.3.7.4 定量方法

將10 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的內(nèi)標(biāo)物2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP）加入到2 g海帶樣品中，通過(guò)計(jì)算待測(cè)揮發(fā)物與TMP峰面積的比值求得各揮發(fā)物的濃度（絕對(duì)校正因子設(shè)定為1），計(jì)算如式（5）所示：

式中：Ax、ATMP分別為待測(cè)揮發(fā)物與內(nèi)標(biāo)物TMP的峰面積；CTMP為加入TMP的質(zhì)量濃度（10 mg/L）；VTMP為加入TMP的體積（10 μL）；mK為加入海帶樣品質(zhì)量（2 g）。

1.3.7.5 氣味活性值分析

氣味活性值（odor activity value，OAV）反映各揮發(fā)物對(duì)樣品整體氣味輪廓的貢獻(xiàn)程度，計(jì)算見式（6）：

式中：Ci和OTi分別為揮發(fā)物i的含量/（ng/g）和氣味閾值/（ng/g）。OAV不小于1的化合物具有氣味活性，可定義為氣味活性物質(zhì)[18]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS Statistics 22.0和Design-Expert 8.0.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理，差異顯著性分析由單因素方差分析（Oneway ANOVA）法完成；采用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對(duì)海帶感官評(píng)分的影響

圖1 發(fā)酵條件對(duì)海帶感官評(píng)分的影響Fig. 1 Effect of fermentation conditions on sensory score of Laminaria japonica

由圖1A可知，隨著酵母添加量的增加，發(fā)酵后海帶樣品的感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酵母添加量為0.15%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高，為70.4。段吳勇[9]結(jié)合電子鼻分析了不同酵母接種量對(duì)海帶腥味感官的影響，結(jié)果表明隨著酵母添加量增加，腥味逐漸減輕；當(dāng)酵母添加量達(dá)到0.60×l08CFU/g時(shí)，脫腥效果最好；而當(dāng)酵母添加量繼續(xù)增加，則會(huì)產(chǎn)生不良的發(fā)酵異味。本研究中，評(píng)價(jià)員從腥味脫除與異味生成兩方面對(duì)海帶樣品氣味進(jìn)行綜合打分，分值高低反映了受評(píng)樣品氣味可接受度大小。隨著酵母添加量的升高，一方面海帶中的腥味物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生消降，另一方面新生成的異味物質(zhì)也在不斷積累（如酵母菌固有氣味），當(dāng)酵母添加量超過(guò)一定限值時(shí)（如大于0.15%），異味物質(zhì)的生成速率可能超過(guò)腥味物質(zhì)的消降速率，從而造成感官評(píng)分下降。綜上可知，酵母添加量選擇0.15%較佳。

由圖1B發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度在24～28 ℃范圍內(nèi)，感官評(píng)分始終呈上升趨勢(shì)，28 ℃時(shí)達(dá)到最高（為70.4）；溫度繼續(xù)升高，感官評(píng)分有所下降但無(wú)顯著性差異，這與段吳勇[9]的研究結(jié)果基本一致，分析原因：在較低溫度（24～28 ℃）下，酵母增殖速率逐步增加，海帶原有的腥味物質(zhì)可能通過(guò)生物轉(zhuǎn)化作用（合成反應(yīng)或結(jié)構(gòu)修飾）變成無(wú)腥味的物質(zhì)，使得感官評(píng)分升高；當(dāng)溫度繼續(xù)上升至30 ℃（酵母最適生長(zhǎng)溫度）時(shí)，酵母增殖速率達(dá)到最大，菌體數(shù)量快速積累[19]，發(fā)酵異味（酵母味等）不斷加重，對(duì)海帶氣味產(chǎn)生不利影響，造成感官評(píng)分下降；發(fā)酵溫度超過(guò)30 ℃，酵母菌體活性將受到抑制，增殖速率減緩，脫腥效果下降。綜上所述，發(fā)酵溫度選擇28 ℃為宜。

由圖1C可知，在30～120 min范圍內(nèi)，感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加（從49.0 分增至70.4 分），超過(guò)120 min，感官評(píng)分稍有下降但無(wú)顯著性差異，分析原因：當(dāng)發(fā)酵時(shí)間未滿120 min時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母菌體處于不斷增殖過(guò)程，海帶中原有的腥味物質(zhì)可能經(jīng)生物轉(zhuǎn)化作用變?yōu)闊o(wú)腥味的物質(zhì)，導(dǎo)致腥味物質(zhì)不斷消降。隨著發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，菌體數(shù)量由于積累效應(yīng)進(jìn)一步增加（酵母味加重），且酵母進(jìn)入穩(wěn)定期之后可能生成新的次生代謝產(chǎn)物，造成海帶異味加重，導(dǎo)致感官評(píng)分下降。綜上，發(fā)酵時(shí)間選擇120 min較好。

2.2 發(fā)酵條件對(duì)海帶pH值的影響

圖2 發(fā)酵條件對(duì)海帶pH值的影響Fig. 2 Effect of fermentation conditions on pH value of Laminaria japonica

由圖2A可知，在0.05%～0.10%范圍內(nèi)，pH值隨酵母添加量的增加而顯著下降；當(dāng)酵母添加量超過(guò)0.10%時(shí)，pH值稍有下降但無(wú)顯著性差異?？追睎|等[20]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間相比，酵母添加量對(duì)發(fā)酵液總酸含量影響最小。圖2B結(jié)果與圖2A類似，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液pH值總體呈遞減趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，pH值降至最小值（6.81）；在26～32 ℃范圍內(nèi)，pH值無(wú)顯著性差異。分析原因：隨著發(fā)酵溫度的升高，酵母活性增加，呼吸作用增強(qiáng)，產(chǎn)生的CO2溶于水后形成碳酸，造成發(fā)酵液pH值下降。30 ℃為酵母最適生長(zhǎng)溫度，此溫度下發(fā)酵液的pH值最低。由圖2C可知，pH值在30～150 min范圍內(nèi)持續(xù)下降，從7.25降至6.75，推測(cè)可能與酵母發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CO2持續(xù)溶于水并形成碳酸有關(guān)。對(duì)比圖2A、2B和2C可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時(shí)間對(duì)pH值的影響程度最大，顯著高于發(fā)酵溫度與酵母添加量，與孔繁東[20]和肖霄[21]等的研究結(jié)果相符。

在海帶發(fā)酵脫腥過(guò)程中，pH值變化不僅會(huì)影響酵母活性[22]，還會(huì)對(duì)海帶葉綠素含量造成影響：如葉綠素在酸性條件下結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生破壞（脫去鎂離子甚至完全分解），導(dǎo)致a*值升高，綠色消失，海帶色澤品質(zhì)劣化。因此，有必要對(duì)海帶發(fā)酵過(guò)程中色差和葉綠素含量等指標(biāo)的變化進(jìn)行研究。

2.3 發(fā)酵條件對(duì)海帶色差的影響

由表2可知，不同條件下海帶L*、a*、b*、ΔE*和Δa*值呈上升趨勢(shì)，而Hue值呈下降趨勢(shì)。海帶中葉綠素含量較為豐富，故其色澤主要與a*值相關(guān)（a*正值代表紅色，負(fù)值代表綠色）。為了更直觀地反映發(fā)酵海帶與原料海帶間的a*值差異，計(jì)算Δa*值，Δa*值越大表示海帶綠色消降越嚴(yán)重，產(chǎn)品色澤越差。由表2可知，隨著酵母添加量的增大，Δa*值逐步升高；酵母添加量為0.15%時(shí)，Δa*值升至最大（0.18）；酵母添加量繼續(xù)升高，Δa*值保持不變。在24～28 ℃范圍內(nèi)，Δa*值隨著發(fā)酵溫度的升高而不斷增加，超過(guò)28 ℃后增幅放緩，表明較高的發(fā)酵溫度會(huì)對(duì)海帶色澤產(chǎn)生不利影響。陳麗麗[23]研究了溫度對(duì)海帶色差的影響，發(fā)現(xiàn)在24 ℃時(shí)，Δa*值較??；當(dāng)溫度升高到32 ℃時(shí)，Δa*值增至0.61，與本研究結(jié)果類似。除上述兩類因素外，發(fā)酵時(shí)間對(duì)海帶色澤也有重要影響。本研究中，在30～120 min范圍內(nèi)，海帶樣品的Δa*值增幅較小，超過(guò)120 min后Δa*值急劇增加，分析原因：酵母發(fā)酵過(guò)程中不斷產(chǎn)生CO2，溶于水后生成碳酸，造成pH值持續(xù)下降。120 min之前可能發(fā)生葉綠素的脫鎂反應(yīng)為主，生成脫鎂葉綠素（呈橄欖綠），導(dǎo)致Δa*值不斷升高；120 min以后脫鎂葉綠素結(jié)構(gòu)可能進(jìn)一步分解破壞，造成Δa*值急劇升高。將各發(fā)酵因素對(duì)海帶色差的影響程度進(jìn)行排序：發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞酵母添加量。

表2 發(fā)酵條件對(duì)海帶色差的影響Table 2 Effect of fermentation conditions on color difference of Laminaria japonica

2.4 發(fā)酵條件對(duì)海帶葉綠素含量的影響

由表3可知，隨著酵母添加量的增加、發(fā)酵溫度的升高以及發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論是葉綠素a含量、葉綠素b含量還是兩者含量之和，均呈不斷下降趨勢(shì)，表明酵母發(fā)酵處理對(duì)海帶中的葉綠素具有明顯的破壞作用。為更直觀地反映各因素對(duì)葉綠素的影響，本研究基于葉綠素a和b的總消降率這一指標(biāo)，對(duì)葉綠素的消降情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。在0.05%～0.20%范圍內(nèi)，葉綠素a和b的總消降率隨著酵母添加量升高而顯著增大，當(dāng)酵母添加量超過(guò)0.20%時(shí)，葉綠素a和b的總消降率略有增大但無(wú)顯著性差異。在24～32 ℃范圍內(nèi)，葉綠素a和b的總消降率隨著發(fā)酵溫度的升高而顯著增大。潘柯伊等[11]指出：在20～40 ℃范圍內(nèi)，海帶中的葉綠素對(duì)熱較為穩(wěn)定。據(jù)此推斷，表3中出現(xiàn)的葉綠素含量隨溫度上升而下降的現(xiàn)象，可能源自酵母的分解作用，而非葉綠素自身的熱降解效應(yīng)。在30～150 min范圍內(nèi)，葉綠素a和b的總消降率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增大，這可能與酵母發(fā)酵過(guò)程不斷產(chǎn)生CO2有關(guān)：CO2溶于水形成碳酸，碳酸不斷積累，使得發(fā)酵液pH值持續(xù)下降（圖2C）。酸性條件下，葉綠素中的鎂離子可被氫離子置換出，變成脫鎂葉綠素（當(dāng)pH值繼續(xù)降低時(shí)其結(jié)構(gòu)甚至?xí)耆茐模瑥亩鴮?dǎo)致海帶綠色消失，色澤品質(zhì)劣化。葉綠素含量變化規(guī)律可與2.3節(jié)中色差變化趨勢(shì)一致。

表3 發(fā)酵條件對(duì)海帶葉綠素含量的影響Table 3 Effect of fermentation conditions on chlorophyll content of Laminaria japonica

表4 a*與葉綠素含量的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between a* and chlorophyll content

由表4可知，無(wú)論是酵母添加量、發(fā)酵溫度還是發(fā)酵時(shí)間，a*值與葉綠素含量間的相關(guān)系數(shù)均在0.7以上，表明兩者結(jié)果一致性較好。此外，a*值與葉綠素a含量間的相關(guān)系數(shù)超過(guò)0.9，顯著高于a*值與葉綠素b含量間的相關(guān)系數(shù)。分析原因：海帶中葉綠素主要以葉綠素a為主（約占80%～90%），且葉綠素a和葉綠素b兩者的呈色特性有所差異（前者呈藍(lán)綠色，后者呈黃綠色）。根據(jù)表4中相關(guān)系數(shù)大小，對(duì)各發(fā)酵因素進(jìn)行排序，結(jié)果顯示：發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞酵母添加量，表明發(fā)酵時(shí)間對(duì)a*值與葉綠素含量的相關(guān)性影響最為顯著。

2.5 基于發(fā)酵后海帶樣品綜合評(píng)分的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與建模分析

為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酵母添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，發(fā)酵后海帶樣品的綜合評(píng)分為響應(yīng)值（Y），采用Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表5。利用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表6。對(duì)表6中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，即可建立各因素與響應(yīng)值之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=0.83＋0.05A-0.11B-0.24C＋1.22AB＋0.08AC＋0.03BC-0.17A2-0.25B2-0.15C2。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Box-Behnken design and experimental results

表6 二次回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of quadratic regression model

由表6可知，所建二次回歸模型的P值為0.000 2小于0.001，表明模型非常顯著；失擬項(xiàng)P值為0.058 3大于0.05，表明模型失擬不顯著，與實(shí)際擬合較好。回歸模型的交互相AB（P=0.013 5）影響顯著，一次項(xiàng)B（發(fā)酵溫度，P=0.003 5）和C（發(fā)酵時(shí)間，P＜0.000 1）、二次項(xiàng)A2（P=0.002 0）、B2（P=0.000 2）和C2（P=0.005 0）影響極顯著，其他一次項(xiàng)（A酵母添加量）和交互項(xiàng)（AC和BC）影響不顯著，表明酵母添加量和發(fā)酵溫度兩因素間存在交互作用。此外，根據(jù)回歸模型各因素的系數(shù)絕對(duì)值A(chǔ) 0.05、B 0.11 和C 0.24，可知各因素對(duì)感官評(píng)分的影響程度依次是：C＞B＞A，即發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞酵母添加量。

2.5.2 兩因素交互作用結(jié)果

圖3 各因素交互作用對(duì)海帶綜合評(píng)分影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig. 3 Three-dimensional response surface and contour plots showing the interactive effects of different factors on sensory score of Laminaria japonica

由圖3a可知，酵母添加量與發(fā)酵溫度對(duì)綜合評(píng)分影響的交互作用顯著（P＜0.05）。如圖3b和3c所示，酵母添加量與發(fā)酵時(shí)間交互項(xiàng)、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間交互項(xiàng)，均對(duì)綜合評(píng)分的影響不顯著（P＞0.05），這與表6方差分析的結(jié)果相一致。

通過(guò)響應(yīng)面法得到酵母脫腥的最優(yōu)工藝條件為酵母添加量0.17%、發(fā)酵溫度27.96 ℃、發(fā)酵時(shí)間102.9 min，此條件下脫腥海帶的綜合評(píng)分Y最高，為0.92 分。

2.5.3 最優(yōu)發(fā)酵工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

考慮實(shí)際需要，對(duì)上述工藝條件進(jìn)行調(diào)整，確定實(shí)際最優(yōu)發(fā)酵工藝為：酵母添加量0.17%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間100 min。在此條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以考察模型的可靠性，結(jié)果表明：實(shí)際最優(yōu)工藝條件下，發(fā)酵海帶感官評(píng)分為74.6 分，與原料海帶的感官評(píng)分（24.5 分）比較，感官評(píng)分增加204.49%；而葉綠素總量由原料海帶的3.83 mg/kg降至2.23 mg/kg，降低41.78%。綜上可知，本研究確定的實(shí)際最優(yōu)發(fā)酵工藝效果良好。

2.6 脫腥前后海帶中的揮發(fā)性風(fēng)味成分變化

采用MMSE-GC-MS法對(duì)脫腥前后的海帶樣品進(jìn)行測(cè)定，共檢出7 大類43 種揮發(fā)性風(fēng)味成分（表7），其中OAV不小于1的氣味活性物質(zhì)有11 種，包括5 種直鏈醛（己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛）和1 種烯醛（2-壬烯醛）、2 種烯醇（1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇）、1 種酮類（2-庚酮）、1 種芳香類（聯(lián)苯）以及1 種雜環(huán)類（2-乙基呋喃）。采用優(yōu)化后的發(fā)酵工藝：酵母添加量0.17%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間100 min，對(duì)海帶進(jìn)行脫腥處理，結(jié)果顯示：無(wú)論是揮發(fā)物種類、總濃度還是OAV總和均顯著下降，具體而言，揮發(fā)物種類減少一半左右，從43 種降至23 種；揮發(fā)物總含量大幅下降，從287.65 ng/g降為151.92 ng/g；氣味活性物質(zhì)減少3 種（2-辛烯-1-醇和2-庚酮被完全脫除，2-乙基呋喃喪失氣味活性）；OAV總和從91.75降至55.28，降幅接近40%。進(jìn)一步分析表7可知，化合物自身結(jié)構(gòu)特性可能對(duì)其脫除效果影響顯著，以O(shè)AV消降值排序：醛類（23.62）＞＞醇類（7.58）＞芳香類（2.43）；以O(shè)AV脫除率排序：酮類（90.70%）＞＞雜環(huán)類（62.44%）＞烴類（57.26%），但機(jī)理有待深入研究。

表7 MMSE-GC-MS法鑒定脫腥前后海帶中的揮發(fā)性成分Table 7 Volatile components identified by MMSE-GC-MS of Laminaria japonica before and after deodorization detection

續(xù)表7

醛類因其閾值較低，通常對(duì)海帶的整體氣味具有重要貢獻(xiàn)。由表7可知，脫腥前后海帶樣品中醛類物質(zhì)總含量以及OAV總和均占所有化合物首位，檢出的11 種醛類均被相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)，表明醛類可能是表征海帶腥味的關(guān)鍵氣味物質(zhì)。由表7可知，己醛是海帶中含量最高的醛類化合物（超過(guò)30 ng/g），與劉智禹等[28]的報(bào)道相符。高濃度的己醛可使海帶具有魚腥味、青草味等不良?xì)馕禰31]，經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵工藝處理，海帶樣品中己醛含量顯著下降，OAV消降值也較高，達(dá)1.64。除己醛外，庚醛、辛醛和癸醛等直鏈醛的濃度在脫腥后也發(fā)生了顯著下降，其中庚醛和辛醛兩者氣味特征相似（同呈魚腥味），經(jīng)脫腥后兩者OAV消降值分別為1.52和1.37（與己醛接近，占據(jù)醛類物質(zhì)前列），表明它們可能在海帶脫腥過(guò)程中貢獻(xiàn)顯著。

醇類是海帶揮發(fā)性風(fēng)味的重要組成。發(fā)酵后海帶樣品中醇類物質(zhì)由5 種降為2 種，總含量由36.87 ng/g降為15.88 ng/g，OAV總和由16.34降到8.76（OAV消降值為7.58，脫除率接近50%）。段吳勇[9]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：發(fā)酵后海帶樣品中所含的醇類物質(zhì)種類大幅減少，濃度降低。據(jù)報(bào)道，1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇是海帶中主要的氣味物質(zhì)[28]，后者呈典型的魚腥味和青草味，可能對(duì)海帶整體腥味貢獻(xiàn)顯著。本研究中，以優(yōu)化工藝發(fā)酵后，海帶中兩種氣味活性醇類1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇OAV均顯著下降（OAV消降值分別為3.50和4.02，脫除率各自達(dá)25.87%和100%）。上述兩種烯醇結(jié)構(gòu)十分相似（為同分異構(gòu)體），但它們的氣味特征和脫除率卻相差較大，原因有待探明。

酮類也是海帶揮發(fā)性風(fēng)味的組成成分。發(fā)酵后海帶樣品中酮類物質(zhì)種類由9 種減少為3 種，總含量由47.84 ng/g降為9.13 ng/g，OAV總和由1.72降到0.16。雖然酮類的OAV脫除率極高（90.70%），但其OAV總和較小，故對(duì)海帶整體氣味影響不大。2-庚酮是酮類中唯一的氣味活性物質(zhì)，經(jīng)發(fā)酵后完全被脫除。1-辛烯-3-酮是含量最高的酮類化合物（14.76 ng/g），呈魚腥味，對(duì)海帶腥味具有一定貢獻(xiàn)，以優(yōu)化工藝發(fā)酵后，海帶樣品中1-辛烯-3-酮的脫除率為100%，與段吳勇[9]的研究結(jié)果類似。

芳香類和烴類由于自身氣味閾值普遍偏低，故可能對(duì)海帶揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。由表7可知，從原料海帶中分別檢出了9 種芳香類和5 種烴類物質(zhì)，總含量分別為67.06 ng/g和26.15 ng/g。除聯(lián)苯外，所有芳香類和烴類物質(zhì)的OAV均小于1，表明其對(duì)海帶整體腥味貢獻(xiàn)較小。值得注意的是，脫腥前后海帶樣品中聯(lián)苯的OAV始終保持較高水平（分別為6.74和4.74），推測(cè)原因：聯(lián)苯為海洋環(huán)境污染物，通過(guò)生物富集作用在海帶中富集，且采用酵母發(fā)酵法難以脫除聯(lián)苯。

2-乙基呋喃是海帶的氣味活性物質(zhì)之一，屬環(huán)氧雜環(huán)類化合物，呈辛辣的橡膠味。采用優(yōu)化工藝發(fā)酵后，海帶中該物質(zhì)的OAV已降至1以下（0.77），表明其氣味活性已喪失。二碘甲烷是原料海帶中被唯一檢出的含碘揮發(fā)物，有特殊的刺激味，在發(fā)酵后的海帶樣品中未被檢出，脫除率達(dá)100%。

3 結(jié) 論

通過(guò)酵母發(fā)酵工藝對(duì)海帶進(jìn)行脫腥處理，綜合考察了酵母添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、發(fā)酵溫度（24、26、28、30、32 ℃）和發(fā)酵時(shí)間（30、60、90、120、150 min）3 個(gè)因素對(duì)海帶感官評(píng)分、pH值、色差、葉綠素含量的影響，結(jié)果表明發(fā)酵時(shí)間對(duì)海帶樣品的感官評(píng)分和色澤品質(zhì)影響最大，發(fā)酵溫度次之，酵母添加量最小。運(yùn)用Box-Behnken 3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將感官評(píng)分與葉綠素總量?jī)身?xiàng)指標(biāo)進(jìn)行離差標(biāo)準(zhǔn)化后再加權(quán)求和，計(jì)算其綜合評(píng)分作為模型響應(yīng)值，確定了海帶發(fā)酵的實(shí)際最優(yōu)工藝：酵母添加量0.17%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間100 min。該工藝下發(fā)酵海帶感官評(píng)分為74.6 分，原料海帶為24.5 分（增幅達(dá)204.49%），葉綠素總量為2.23 mg/kg，原料海帶為3.83 mg/kg（降幅為41.78%），發(fā)酵效果總體良好。采用MMSE-GC-MS法分析了發(fā)酵前后海帶樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，共檢出7 大類43 種揮發(fā)物，確定己醛等11 種氣味活性物質(zhì)（OAV≥1）。與原料海帶相比，發(fā)酵后海帶中揮發(fā)物種類從43 種降至23 種，揮發(fā)物總含量與OAV總和分別下降135.73 ng/g和36.47，降幅分別為47.19%和39.75%，脫腥效果顯著?；衔镒陨斫Y(jié)構(gòu)特性可能對(duì)其脫除效果影響顯著，發(fā)酵海帶樣品中醛類的OAV消降值最大（23.62），而酮類的消降率最高（90.70%），原因有待后續(xù)深入探討。