離子阱質(zhì)譜測(cè)定脂質(zhì)鑒別深海魚(yú)油

李 鑫，劉 霞*，李培武*，王秀嬪

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（武漢），農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062）

自20世紀(jì)70年代，深海魚(yú)油被報(bào)道含有多元不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸（docose hexaenoie acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），深海魚(yú)油就一直以其在保健、疾病預(yù)防等方面的顯著作用而備受人們關(guān)注[1]。深海魚(yú)油中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是EPA和DHA，其對(duì)精神疾病如各種類(lèi)型的癡呆、認(rèn)知障礙[2-3]、阿爾茲海默病等[4-6]表現(xiàn)出明顯的治愈效果；對(duì)于降低血脂[7]、預(yù)防腦血栓[8-9]、中風(fēng)及腦溢血、預(yù)防血液凝固等心血管疾病也有顯著療效[10-11]；同時(shí)也有研究表面，深海魚(yú)油中的不飽和脂肪酸與人體腫瘤、糖尿病、抗炎機(jī)制[12-13]等都有著密切相關(guān)[14-18]。

目前市場(chǎng)上的深海魚(yú)油主要分為乙酯型和甘油酯型2 種，2 種不同類(lèi)型的深海魚(yú)油功效不同，價(jià)格差異大。甘油酯型魚(yú)油是DHA和EPA天然的存在形式，食用安全，易被人體消化吸收[19]，是人們能普遍接受的一種產(chǎn)品形式。據(jù)報(bào)道[20-21]，2 種不同類(lèi)型的深海魚(yú)油有著較大差異，甘油酯型魚(yú)油與乙酯型魚(yú)油相比，其吸收率高達(dá)乙酯型魚(yú)油的3 倍，因?yàn)楦视腿ツ鼙蝗梭w胰臟和肝臟的主要脂肪酶專(zhuān)一性水解[22-23]，而乙酯型魚(yú)油卻不能被有效水解而釋放游離脂肪酸以被人體吸收[24-25]。此外，乙酯型魚(yú)油也有著功能上的缺陷，乙酯型魚(yú)油在胃腸道能分形成乙醇，對(duì)乙醇耐受性不良的人容易引起不良反應(yīng)，如過(guò)敏癥，尤其不適宜兒童食用；乙酯型魚(yú)油脂肪酸被小腸吸收后進(jìn)入人體通常會(huì)被作為能源物質(zhì)供能而被氧化，影響了魚(yú)油的保健功效[26-27]；長(zhǎng)期以脂肪酸、乙醇作為膳食來(lái)源，也易引起人體內(nèi)甘油的缺失或不足，從而拉動(dòng)人體糖代謝，這樣易造成人體內(nèi)糖代謝不平衡從而產(chǎn)生一定的副作用[28-29]。目前對(duì)于2 種不同類(lèi)型深海魚(yú)油的鑒別研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，對(duì)深海魚(yú)油中不飽和脂肪酸如EPA、DHA的研究主要通過(guò)氣相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[30-31]等手段，其前處理復(fù)雜、需要衍生，成本損耗較大，且精密度不高[32-33]。本研究運(yùn)用高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜的方法，通過(guò)數(shù)據(jù)依賴(lài)型掃描所獲得的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)，加以二級(jí)特征分子碎片離子峰的輔助驗(yàn)證，能準(zhǔn)確鑒別乙酯型和甘油酯型的深海魚(yú)油，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同品牌深海魚(yú)油樣品（乙酯型深海魚(yú)油2 個(gè)，甘油酯型深海魚(yú)油7 個(gè)） 市購(gòu)；甲醇（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；異丙醇（色譜純） 北京百靈威科技有限公司；正己烷、乙腈（均為色譜純） 安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；乙酯酰基EPA、乙酯?；鵇HA、十六碳烯酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Surveyor液相色譜儀包括四元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、LTQXL質(zhì)譜檢測(cè)器、離子源為大氣壓化學(xué)電離源）、Hypersil GOLD C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm） 美國(guó)Thermo Scientific公司；CPA224S電子分析天平 德國(guó)Sartorius公司；微量移液槍 德國(guó)Eppendorf公司；KQ-300E超聲儀 中國(guó)昆山儀器有限公司；0.22 μm一次性有機(jī)濾膜 美國(guó)Millipore公司；HQ-60型渦旋混合器北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱(chēng)取30 mg深海魚(yú)油，采用異丙醇-乙腈-正己烷（2∶2∶1，V/V）混合溶劑提取獲得其中脂質(zhì)組分后，用甲醇-異丙醇（1∶1，V/V）溶液稀釋100 倍，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣到高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中分析，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 色譜條件

Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流動(dòng)相A相為異丙醇，B相為乙腈，梯度洗脫：0 min，10% A，90% B；20 min，59% A，41% B；20.01～25 min，10% A，90% B（按體積分?jǐn)?shù)計(jì)）；流速200 μL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

大氣壓化學(xué)電離源；正離子采集模式；掃描模式：數(shù)據(jù)依賴(lài)型二級(jí)掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 200；離子源溫度275 ℃；毛細(xì)管溫度275 ℃；鞘氣壓力30 psi；輔助氣壓力5 psi；碰撞能量35 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)采集到的質(zhì)譜圖和出峰保留時(shí)間與脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.lipidmaps.org/）比對(duì)，進(jìn)行定性分析。數(shù)據(jù)處理采用Xcalibur軟件（Version 2.0.7，美國(guó)Thermo公司），對(duì)峰面積積分并計(jì)算，進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酯?；鵈PA和乙酯?；鵇HA識(shí)別及多級(jí)質(zhì)譜特征

圖1 乙酯?；鵈PA和乙酯?；鵇HA一級(jí)質(zhì)譜圖（A）及其對(duì)應(yīng)二級(jí)質(zhì)譜圖（B、C）Fig. 1 Mass spectra (A) and tandem mass spectra (B, C) of ethyl acetyl EPA and ethyl acetyl DHA

如圖1A所示，乙酯酰基EPA特征分子離子峰（[CH3CH2O-EPA＋H]＋，m/z 331.3）和乙酯酰基DHA特征分子離子峰（[CH3CH2O-DHA＋H]＋，m/z 357.4）。如圖1B、C所示，在分子離子峰二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中分別出現(xiàn)了其碎片離子[EPA-OH]＋（m/z 285.27）和[DHA-OH]＋（m/z 311.28）。

2.2 三酰甘油酯識(shí)別及多級(jí)質(zhì)譜特征

圖2 PoEPADHA一級(jí)質(zhì)譜圖（A）和對(duì)應(yīng)二級(jí)質(zhì)譜圖（B）Fig. 2 Mass spectra (A) and tandem mass spectra (B) of PoEPADHA

三酰甘油酯在離子阱多級(jí)質(zhì)譜中的碎裂方式是一級(jí)分子離子峰會(huì)任意丟失一個(gè)脂肪酸中性碎片而形成二級(jí)碎片離子，通過(guò)將一級(jí)分子離子和二級(jí)碎片離子信息與脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.lipidmaps.org/）進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合一級(jí)分子離子和二級(jí)碎片離子的m/z特征信息可推測(cè)丟失的脂肪酸種類(lèi)，從而識(shí)別甘油三酯，如圖2A所示，一種甘油三酯組分PoEPADHA的分子離子峰[PoEPADHA＋H]＋（m/z 923.63）會(huì)失去任意一個(gè)脂肪酸中性碎片而形成二級(jí)碎片離子[EPADHA]＋（m/z 671.50）、[PoDHA]＋（m/z 621.50）和[PoEPA]＋（m/z 595.47），見(jiàn)圖2B，由此可識(shí)別該組分為PoEPADHA。

2.3 乙酯型深海魚(yú)油和甘油酯型深海魚(yú)油脂質(zhì)差異分析

表1 甘油酯型魚(yú)油中甘油三酯定性結(jié)果Table 1 Qualitative analysis of triglycerides of glyceride-type fish oils

如圖3A所示，2.86 min處有乙酯?；鵈PA分子離子峰（[CH3CH2O-EPA＋H]＋，m/z 331.34）和乙酯?；鵇HA分子離子峰（[CH3CH2O-DHA＋H]＋，m/z 357.41）的色譜峰。如圖3B所示，5.5～18 min之間的峰為甘油酯型深海魚(yú)油中脂質(zhì)組分包括三酰甘油?；鵈PA和三酰甘油?；鵇HA多組分的手指形色譜峰。甘油酯型深海魚(yú)中可識(shí)別的甘油三酯見(jiàn)表1。因此，鑒別乙酯型深海魚(yú)油和甘油酯型深海魚(yú)油的方法為只含有乙酯?；鵈PA和乙酯酰基DHA，該樣品即為乙酯型深海魚(yú)油；樣品中只含有三酰甘油?；鵈PA和三酰甘油?；鵇HA，且不含有乙酯?；鵈PA和乙酯酰基DHA，該樣品即為甘油酯型深海魚(yú)油。

2.4 鑒別方法驗(yàn)證結(jié)果

表2 不同脂質(zhì)在魚(yú)油樣品中的相對(duì)含量Table 2 Relative contents of different lipids in fish oil samples

選用9 份魚(yú)油樣品進(jìn)行方法驗(yàn)證，如表2所示。乙酯型魚(yú)油特征標(biāo)志物CH3CH2O-EPA，CH3CH2O-DHA存在于樣品2和樣品9中，而在其他樣品中未檢出。同時(shí)樣品1、3～8中只存在甘油酯型魚(yú)油的特征物。由此可說(shuō)明，樣品2、9為乙酯型魚(yú)油，其余為甘油酯型魚(yú)油。

3 結(jié) 論

本研究建立基于高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀的脂質(zhì)識(shí)別技術(shù)，以及鑒別乙酯型和甘油酯型深海魚(yú)油的方法。通過(guò)總離子流、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜離子樹(shù)識(shí)別脂質(zhì)指紋信息，從而對(duì)魚(yú)油樣品進(jìn)行定性，可精確鑒別乙酯型魚(yú)油和甘油酯型魚(yú)油，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)的建立為保證市場(chǎng)上深海魚(yú)油的質(zhì)量安全提供理論依據(jù)。