頭痛寧膠囊對(duì)偏頭痛大鼠血清中NO、腦組織中5-HT、β-EP的影響*

盛 剛,張雪慧，郭 珍

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)，2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

主題詞 偏頭痛/中西醫(yī)結(jié)合療法 @頭痛寧膠囊 β-內(nèi)啡肽 一氧化氮 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠

偏頭痛是一種常見的臨床頭痛，其特征為陣發(fā)性，大多疼痛位置位于偏側(cè)，程度為中度至重度，形式多為搏動(dòng)樣頭痛，通常持續(xù)4～72 h，發(fā)病時(shí)伴隨癥狀可有惡心、嘔吐，通常光、聲刺激或日?；顒?dòng)可加劇頭痛，而安靜的環(huán)境或者經(jīng)過休息可緩解頭痛[1]。頻繁發(fā)作和程度嚴(yán)重的頭痛，會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，造成患者學(xué)習(xí)能力及工作能力的下降。目前更加得到認(rèn)可的偏頭痛發(fā)病理論是CSD和三叉神經(jīng)血管反射理論，前者是目前被認(rèn)可的偏頭痛先兆的重要機(jī)制，而后者可以更全面地解釋偏頭痛的病理生理過程并被廣泛接受[2]。頭痛寧膠囊源自清·陳士鐸《辨證錄·頭痛篇》中“散偏湯”，是陜西省名中醫(yī)楊秀清教授在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，在“散偏湯”基礎(chǔ)上加減化裁研制而成的純中藥制劑，藥物組成有川芎、生白芍、香附、地龍等九味藥物。本文主要通過研究頭痛寧膠囊對(duì)偏頭痛模型動(dòng)物的血清中一氧化氮(NO)和腦組織中5-羥色胺(5-HT)、β-內(nèi)啡肽(β-EP)水平變化來評(píng)價(jià)其在偏頭痛中的治療作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠60只，雌雄各30只，(200±20)g。第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按體重隨機(jī)分成空白組、模型組、陽性對(duì)照正天丸組、頭痛寧膠囊大劑量組、頭痛寧膠囊中劑量組、頭痛寧膠囊小劑量組，每組10只。

2 藥物與試劑 頭痛寧膠囊，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供，配制成藥物混懸液后根據(jù)大中小劑量組0.15，0.3，0.6 g/kg給藥。正天丸，由三九醫(yī)藥股份公司生產(chǎn)，每袋凈重6 g，按大鼠體重1.24 g/kg給藥。戊巴比妥鈉：上海國(guó)際集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。鹽酸：西安富力化學(xué)試劑廠。氫氧化鈉：西安怡和化工廠。硝酸甘油注射液：北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，每ml含硝酸甘油5 mg。5-羥色胺免疫組化試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色劑：武漢博士德生物醫(yī)藥有限公司。NO硝酸還原酶法試劑盒：南京建成生物工程研究所。125I-β-內(nèi)啡肽放射免疫測(cè)定試劑盒：解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室。

3 實(shí)驗(yàn)儀器 KDC-40低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。OLYMPUS CX31型電子顯微鏡：日本OLYMPUS公司。DK-8A型電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。KE-WEI電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠。723分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。FJ-2103γ免疫計(jì)數(shù)儀：西安二六二廠。石蠟包埋機(jī)：HISTOCENTRE，英國(guó)。石蠟切片機(jī) ：FINESSE，英國(guó)。電子天平：瑞士產(chǎn)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

4 實(shí)驗(yàn)方法 空白組灌胃0.9%氯化鈉注射液10 ml/kg，陽性對(duì)照正天丸組按10 ml/kg灌胃正天丸；頭痛寧膠囊大、中、小劑量組分別按10 ml/kg灌胃。各組動(dòng)物每天灌胃給藥1次，連續(xù)用藥7 d。各組動(dòng)物造模后30 min后分組給藥1次，空白組不作處理。使用硝酸甘油建模方法。根據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道的方法，SD大鼠皮下注射硝酸甘油注射液10 mg/kg，建立實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物模型，以造模30 min后大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅，頻繁撓頭，爬籠等煩躁表現(xiàn)為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組大鼠皮下注射等體積生理鹽水[4]。造模4 h后，腹腔注射 2%的戊巴比妥鈉，按照 0.2 ml/100g 的劑量進(jìn)行麻醉[5]。以4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定后,斷頭取腦[6]，分離出下丘腦，置于稱量杯中用電子天平稱重。在沸生理鹽水中煮5 min，以滅活酶，保持神經(jīng)肽的穩(wěn)定[7]。放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入 0.1N 鹽酸 0.5 ml于勻漿器中勻漿，于 4℃ 條件下放置1h～2h，再用0.1N 的 NaOH 0.5ml中和，4℃離心(3000rpm )30 min，取上清液于 EP管中，-20 ℃ 凍存待測(cè)[8]。將腦組織包括腦干放入預(yù)冷的4%多聚甲醛液溶液中12 h，0.1M PBS 4℃過夜，然后置于梯度乙醇脫水，脫水后浸潤(rùn)蠟包埋，行冠狀切片，切片厚度5 μm，每片組織切片間隔1 mm，置烘箱60℃ ，60 min干燥，保存試驗(yàn)[9]。

5 指標(biāo)檢測(cè)

5.1 一氧化氮(NO)、β-內(nèi)啡肽(β-EP)、5-羥色胺(5-HT)含量檢測(cè)： 嚴(yán)格按照試劑盒說明使用硝酸還原酶法測(cè)定血清NO，并用723分光光度儀測(cè)量血清中NO含量。NO檢測(cè)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成。β-EP的檢測(cè)按照β-內(nèi)啡肽放射免疫測(cè)定藥盒說明書的步驟進(jìn)行，并用免疫計(jì)數(shù)儀測(cè)量下丘腦中β-EP含量。放射免疫檢測(cè)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院同位素室完成。5-HT的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)SABC法。免疫組化檢測(cè)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心完成。

5.2 鏡檢： 熒光顯微鏡下：陽性細(xì)胞質(zhì)棕色，主要為圓形或橢圓形，有黑色細(xì)胞核。 在高倍率(40×10)顯微鏡下觀察每個(gè)切片的左上，右上，左下，右下和中心部分中的陽性細(xì)胞的數(shù)目，并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的數(shù)目，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

結(jié) 果

1 行為學(xué)改變 各組造模動(dòng)物表現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。除空白對(duì)照組外，其余組別建模10min左右，大鼠均出現(xiàn)雙耳發(fā)紅，頻繁撓頭、爬籠等煩躁表現(xiàn)。治療組中的大鼠在給藥后癥狀逐漸消失。上述現(xiàn)象模型組持續(xù)約3～4 h，然后出現(xiàn)蜷縮，活動(dòng)減少的狀態(tài)。

2 頭痛寧膠囊對(duì)血清NO含量、腦干組織5-HT含量、下丘腦組織β-EP含量的影響

2.1 頭痛寧膠囊對(duì)血清NO含量的影響:動(dòng)物血清模型組中NO的含量增高明顯,與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),說明造模成功。頭痛寧大、中、小量組NO含量與模型組相比的均非常顯著下降(P<0.01),頭痛寧膠囊小量組與對(duì)照正天丸組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

2.2 頭痛寧膠囊對(duì)腦干組織5-HT含量的影響：模型組動(dòng)物腦干組織中5-HT的陽性細(xì)胞數(shù)與空白組相比明顯減少(P<0.01)。頭痛寧大、中量組5-HT陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加,大量組與模型組、空白組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),頭痛寧中量組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而且頭痛寧膠囊大量組比陽性對(duì)照正天丸組相比5-HT陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加更明顯(P<0.01)。其他組別與正天丸組、空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表1 頭痛寧膠囊對(duì)血清NO含量的影響

注：與空白組相比，△P<0.01,☆P<0.05；與模型組相比，□P<0.01；與正天丸組相比,P>0. 05

表2 頭痛寧膠囊對(duì)腦干組織5-HT含量的影響

注：與空白對(duì)照組相比，△P<0.01；與模型組相比，□P<0.01，☆P<0.05；與正天丸組相比，◇P<0.01

2.3 頭痛寧膠囊對(duì)下丘腦組織β-EP含量的影響:模型組動(dòng)物下丘腦組織中β-EP的含量與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；除頭痛寧大量組與模型組及空白組比較明顯增高外(P<0.01),其余各組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。然而頭痛寧大量組與陽性對(duì)照正天丸組比卻有非常顯著性差異(P<0.01)，見表3。

表3 頭痛寧膠囊對(duì)下丘腦組織β-EP含量的影響

注：與空白對(duì)照組相比，△P<0.01 ；與模型組相比，☆P<0.01 ；與正天丸組相比，◇P<0.01

討 論

眾所周知，NO在偏頭痛和其他血管性頭痛的機(jī)制中起關(guān)鍵作用[11]。其可通過擴(kuò)張血管，引發(fā)神經(jīng)源性炎癥，激活損傷感覺神經(jīng)元的敏感性，介導(dǎo)身體的疼痛信號(hào)傳遞，從而放大其生物學(xué)作用，導(dǎo)致疼痛的發(fā)生[12]。本實(shí)驗(yàn)為經(jīng)典偏頭痛模型，采用注射硝酸甘油后使動(dòng)物血中NO的含量迅速增加，NO具有神經(jīng)毒性作用，可刺激三叉神經(jīng)-血管反射，引起腦血管擴(kuò)張，導(dǎo)致偏頭痛[13]。頭痛寧大、中、小量組NO的含量明顯減少(P<0.01)，與空白組比較沒有差異，表明頭痛寧膠囊可下調(diào)由硝酸甘油誘發(fā)的NO大量生成，減少由NO介導(dǎo)的無菌炎癥和血管周圍的神經(jīng)毒性，從而緩解偏頭痛的發(fā)作。

5-羥色胺(5-HT)既是神經(jīng)遞質(zhì)，也是體液介質(zhì)[14]。5-HT在偏頭痛中的重要作用已經(jīng)逐漸被認(rèn)，偏頭痛發(fā)作前血漿中的5-HT增加，不僅直接收縮血管，而且通過增加去甲腎上腺素的血管收縮作用，引起先兆期血管痙攣收縮[15]。頭痛發(fā)作期，5-HT迅速代謝為5-HIAA，血中5-HT濃度比原來減少40%，5-HT的減少引起頭皮血管反彈和偏頭痛血管擴(kuò)張性疼痛[16]。本實(shí)驗(yàn)硝酸甘油模型偏頭痛大鼠血中5-HT含量明顯下降，造模后使動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能受到影響，使腦內(nèi)5-HT大量釋放，引起血管舒縮功能的異常，血管擴(kuò)張，腦血流灌注量減少，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性偏頭痛，而5-HT快速降解，導(dǎo)致腦中5-HT含量降低，導(dǎo)致模型組中5-HT陽性細(xì)胞數(shù)目的顯著減少。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，頭痛寧大量組腦干5-HT陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P<0.01)，說明頭痛寧膠囊在一定程度上可阻止或延緩5-HT的降解，抑制傷害性信息的傳入,并改善血管的舒縮功能障礙，因此調(diào)節(jié)由于5-HT誘導(dǎo)的血管收縮、舒張紊亂而延緩偏頭痛的發(fā)作[17]。

β-內(nèi)啡肽(β-EP)是α-內(nèi)源性阿片肽，內(nèi)源性阿片樣肽具有強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用。 在體內(nèi)內(nèi)啡肽系統(tǒng)障礙的情況下，β-EP釋放立即下降，而腦干藍(lán)斑的抑制減弱，使各種血管活性物質(zhì)增加，機(jī)體的疼痛閾值也下降，更容易發(fā)生偏頭痛[18]。β-EP抑制P物質(zhì)的釋放,從而抑制脊髓和三叉神經(jīng)管的原始神經(jīng)感覺的疼痛[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示由NO誘發(fā)內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)紊亂-β-EP功能紊亂。經(jīng)過給藥干預(yù)后，β-EP含量回升，表明頭痛寧膠囊可上調(diào)由硝酸甘油誘導(dǎo)的β-EP產(chǎn)生的水平，其傾向于平衡生理狀態(tài)，以達(dá)到緩解偏頭痛發(fā)作和改善癥狀的目的。

頭痛寧膠囊是陜西省名中醫(yī)楊秀清教授在《辨證錄》散偏湯的基礎(chǔ)上加減而成，藥用川芎、白芍、柴胡、香附、白芷、地龍等十味藥組成。具有祛風(fēng)清熱、通絡(luò)止痛的功效，用于治療風(fēng)熱上擾，腦脈閉阻之頭痛。方中川芎辛、溫，歸肝、膽、心包經(jīng)，活血行氣、祛風(fēng)止痛，為血中之氣藥，能上行頭目，下行血海，上達(dá)頭面，外透肌膚，走而不守，為“諸經(jīng)頭痛要藥”，為治頭痛之要藥。白芍苦、酸、甘，微寒。入肝脾血分，養(yǎng)血柔肝，瀉肝經(jīng)火邪，緩攣急止疼痛，《本草備言》：“補(bǔ)血，瀉肝，益脾，斂肝陰?！卑总茪馕缎料阕吒Z，與活血藥配伍使用加強(qiáng)其活血作用，并能宣清竅，使竅通血活，而痛止。柴胡散瘀熱、疏肝郁，為治療少陽頭痛之要藥，香附，疏肝理氣調(diào)經(jīng)止痛，為理氣良藥，三者共為臣藥，疏肝解郁，以助川芎、白芍行氣止痛。佐以地龍清熱熄風(fēng)通絡(luò)頭痛。本研究中，皮下注射硝酸甘油注射大鼠制作實(shí)驗(yàn)偏頭痛模型，結(jié)果表明，硝酸甘油注射后，大鼠血清N0、腦內(nèi)5-HT、β-EP的含量都有明顯變化，NO的含量呈增高趨勢(shì)，而5-HT、β-EP含量呈下降趨勢(shì)，頭痛寧膠囊可以下調(diào)由硝酸甘油誘發(fā)的NO大量生成的水平，可以上調(diào)由硝酸甘油誘發(fā)的5-HT、β-EP的生成減少的水平，使其接近正常生化水平。這種作用的聯(lián)合作用可以抑制一系列在偏頭痛發(fā)作中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的惡性循環(huán)，并將有害物質(zhì)降低到平衡水平的生理狀態(tài)，從而產(chǎn)生止痛效應(yīng)。由此可說明頭痛寧膠囊可以調(diào)節(jié)身體的神經(jīng)遞質(zhì)分泌，調(diào)節(jié)血管舒縮障礙，抑制傷害感受信息的傳遞，并在鎮(zhèn)痛中起作用。