芽孢桿菌源抗菌肽類物質(zhì)研究進展

龔發(fā)源，胡駿鵬，曾雨雷，戴晉軍，王玉蓮

（1.華中農(nóng)業(yè)大學 國家獸藥殘留基準實驗室（HZAU），國家獸藥安全評價實驗室，湖北武漢 430070；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003）

20世紀以來，抗生素在防治人類和畜禽細菌性感染等疾病方面發(fā)揮了巨大作用，但是隨著抗生素特別是廣譜抗生素的長期使用或濫用導(dǎo)致的細菌耐藥性問題日益嚴重，世界衛(wèi)生組織（WHO）稱多重耐藥性的出現(xiàn)導(dǎo)致人類對于病原微生物的防治力和控制力正在不斷下降（Parisien 等，2008）。美國社會感染性疾病研究中心的報告稱在2004年公布的關(guān)于急性感染性病例的病原菌中有超過70%的細菌對至少一種治療病原微生物常用的抗生素具有耐藥性（Hassan 等，2012），交叉耐藥性的問題也導(dǎo)致新型藥物開發(fā)愈加困難。因此，開發(fā)新型、高效、安全的抗微生物藥物以應(yīng)對嚴重的病原菌感染及病原微生物耐藥性的雙重壓力顯得尤為緊迫（Clardy 等，2006），而某些微生物合成的天然抗菌活性物質(zhì)（抗菌肽）展現(xiàn)出作為替代品的巨大潛力（Cotter 等，2013）。

1 抗菌肽的概念

微生物產(chǎn)生的抗菌肽（AMPs）是一類陽離子或者兩性的小分子多肽（＜10 kDa），具有天然抗菌活性，根據(jù)其合成途徑主要分為核糖體合成抗菌肽和非核糖體合成抗菌肽（Abriouel 等，2011）。其中核糖體合成抗菌活性肽類物質(zhì)通常稱為細菌素，前體在核糖體合成后需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾才形成有活性的物質(zhì)；而非核糖體肽則是一種肽類次級代謝產(chǎn)物，多由常見氨基酸、特殊修飾氨基酸組成，主要通過多功能酶復(fù)合體系統(tǒng)合成，并進一步被修飾，比如環(huán)化、?；?、雜環(huán)化、甲基化和糖基化等，進而形成具有生物活性的分子肽。

目前已經(jīng)有超過2000余種來源于植物、動物、病毒、細菌和真菌的抗菌肽類物質(zhì)，抗菌肽較傳統(tǒng)抗生素而言，具有副作用小和病原菌產(chǎn)生抗性的幾率低等特點?？咕哪軌蜃鳛橹委熂毦腥尽⒄婢腥疽约凹纳x感染的新型藥物，同時某些抗菌肽還具有抗病毒作用（Brogden等，2011）。

2 芽孢桿菌與抗菌肽

芽孢桿菌是一類兼性厭氧或者好氧，革蘭氏陽性桿菌的總稱，可產(chǎn)芽孢，生理特征多樣，廣泛分布于植物體表和根系、土壤、空氣。大量研究表明芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種具有較廣抗菌譜的活性物質(zhì)，這些抗菌物質(zhì)大多屬于多肽類（Sabate 等，2013）。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽具有抑制霉菌等真菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌的生物活性，部分還具有抗病毒和抗支原體的特性。

芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽類物質(zhì)根據(jù)化學結(jié)構(gòu)組成主要分為細菌素、糖肽類、脂肽類和環(huán)狀肽類。而根據(jù)其合成途徑則主要被分為多酶復(fù)合體系統(tǒng)合成的非核糖體抗菌肽以及核糖體合成的抗菌肽兩類，這也是目前對于芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽類物質(zhì)的常見分類方法（Li 等，2012）。

2.1 非核糖體合成抗菌肽 芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽如短桿菌肽、桿菌肽、表面活性肽、伊枯草菌素、豐原素等都主要是通過多酶復(fù)合體催化氨基酸殘基縮合而成，屬于非核糖體合成類抗菌肽。這些非核糖體合成抗菌肽形態(tài)各異，包括線型、環(huán)狀等，環(huán)狀支鏈上連接羥基、L型氨基酸或者D型氨基酸。同時，前期形成的小分子肽還可能經(jīng)過N端甲基化、乙?；刃揎?，形成結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜的活性肽（Hancock等，1999）。目前芽孢桿菌產(chǎn)生的非核糖體合成抗菌肽，根據(jù)其具體的結(jié)構(gòu)差異主要分為表面活性肽（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和豐原素（fengycin）三大家族（表 1）。

2.1.1 表面活性肽 表面活性肽家族是目前研究較全面的一類非核糖體合成抗菌肽，枯草芽孢桿菌中首次發(fā)現(xiàn)表面活性肽的存在（Arima等，1968），然而目前已報道的包括 surfactins、esperin、linchenysin、pumilacidin等在內(nèi)約 20種表面活性肽類物質(zhì)是由多種芽孢桿菌合成。其本質(zhì)為環(huán)狀脂肽類物質(zhì)，基本結(jié)構(gòu)包括一個由七個氨基酸（LLDLLDL）縮合形成的七肽環(huán)狀內(nèi)酯，并且連接有一條13～15個碳原子組成的β羥基脂肪酸鏈（Peypoux等，1999）。除 esperin外，這些脂類肽的3位和6位均是D-亮氨酸，4位為L-天冬氨酸。早期研究認為表面活性肽家族的區(qū)別主要在于脂肪酸鏈的長度，但是最近的研究認為除了脂肪酸鏈，末端氨基酸殘基的不同也可以用于區(qū)分家族的同源性（Defaria等，2011）。根據(jù)與β羥基脂肪酸鏈形成內(nèi)酯環(huán)的末端氨基酸不同，目前通常把表面活性肽surfactins分為三大類，即surfactin A、surfactin B、surfactin C，三者末端氨基酸分別為L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸。

表1 芽孢桿菌產(chǎn)生的主要非核糖體合成抗菌肽

表面活性肽家族具有強大的表面活性劑特性，研究發(fā)現(xiàn)濃度為20 μmol/L表面活性肽可使水的表面活性張力從72 mN/m降至27 nN/m（Peypoux等，1999）。作為生物表面活性物質(zhì)，表面活性肽具有雙親性，與化學合成表面活性劑相比具有更高效的活性，能夠耐受高溫或極性pH，毒性更低且可以自然降解等優(yōu)點。而且，部分表面活性肽還具有乳化、發(fā)泡、抗病毒、抗支原體、抗植物病原性真菌、殺蟲及酶抑制等生理特性。Sabate等（2009）發(fā)現(xiàn)一種由B.subtilis C4合成的表面活性肽，0.125 mg/mL的濃度能夠有效抑制致病性李斯特菌屬。此外報道稱5%胎牛血清（FCS）中添加25 mmol/L表面活性肽能夠抑制Semliki森林病毒（SFV）、單純孢疹病毒（HSV-1，HSV-2）、水皰性口炎病毒（VSV）、猿猴免疫缺陷病毒（SIV）、貓杯狀病毒（FCV）鼠科類腦心肌炎病毒（EMCV）等病毒的生物活性。因此表面活性肽也被作為一種潛在的抗病毒藥物。

2.1.2 伊枯草菌素 伊枯草菌素家族主要是一類環(huán)狀脂肽類抗菌物質(zhì)，大部分是由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生，目前研究已知的主要包括四種伊枯草菌素（iturin A 、C、D、E）、五種芽孢菌霉素和抗霉枯草菌素。伊枯草菌素家族結(jié)構(gòu)特性包括一個固定氨基酸序列（LDDLLDL）以及一條由14～17個碳原子組成的通過β肽鍵連接在3位碳原子的疏水性β氨基脂肪酸鏈尾巴（Hourdou等，1989）。Iturin A、iturin D、iturin E三者的主要區(qū)別在于固定氨基酸序列中的氨基酸組成的差異，iturin A中一個天冬酰胺或者谷氨酰胺酸殘基被天冬氨酸或者谷氨酸取代就是iturin D，被Asp-OCH3或者Glu-OHS取代則是iturin E，而相比于iturin A，iturin C是不具有抗菌活性的（Peypoux等，1999）。而芽孢菌霉素和抗霉枯草菌素與伊枯草菌素結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別則在于4、5、6、7位氨基酸的組成。早期研究認為伊枯草菌素家族抗菌肽主要來源于枯草芽孢桿菌，然而最近研究發(fā)現(xiàn)在其他芽孢桿菌中也發(fā)現(xiàn)伊枯草菌素家族類抗菌物質(zhì)（Yu等，2002）。

伊枯草菌素家族對真菌如霉菌、酵母菌具有良好的抑制作用，對細菌作用較弱（Besson等，1987），對病毒類基本上沒有抑制作用。Klich等（1991）使用紙片法研究發(fā)現(xiàn)iturin A對于枯青霉菌、鮮綠青霉等真菌的最低抑菌濃度（MIC）低至每個紙片含量4 μg。廣泛的抗真菌譜、低毒及低過敏反應(yīng)、易生物降解等優(yōu)點使得伊枯草菌素家族作為長效植物生防藥物而被廣泛研究和應(yīng)用。對比伊枯草菌素家族結(jié)構(gòu)與功能發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)組成中自由羧基的位點及長度均可影響其生物活性，同時β氨基脂肪酸鏈中碳原子數(shù)目增多也能增強伊枯草菌素的抗菌活性（Besson等，1987）。

2.1.3 豐原素 豐原素家族主要來源于枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌等，主要包括fengycin A、B以及其同源化合物如plipastatin。兩者的差別在于9位氨基酸，fengycin為L-酪氨酸，而plipastatin則為D-酪氨酸。豐原素家族的結(jié)構(gòu)特征為十肽，其中8個氨基酸組成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另外兩個氨基酸上連接一個β-羥脂肪酸鏈（一般13～17個碳原子）。氨基酸結(jié)構(gòu)類型為LDLDLDDLLDL，其中L-酪氨酸與L-異亮氨酸形成內(nèi)酯鍵而成環(huán)（Lin等，2005）。而fengycin A與fengycin B的結(jié)構(gòu)區(qū)別主要在于6位氨基酸，fengycin A為D-丙氨酸，fengycin B為D-纈氨酸；此外兩者在脂肪酸鏈的碳原子數(shù)目上也存在一定差異。

研究發(fā)現(xiàn)豐原素與伊枯草菌素相比具有更強的抗真菌活性，特別是對絲狀真菌類，并且它的溶血性更弱（Steller等，1999）。目前豐原素被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病原性真菌的防治，如禾谷鐮刀菌、黃瓜立枯病菌等，同時伊枯草菌素與豐原素聯(lián)合使用時具有明顯的協(xié)同作用。

2.1.4 其他非核糖體合成抗菌肽 非核糖體合成抗菌肽除了三大家族外還包括許多其他抗菌肽類物質(zhì)。比如Hagelin等（2007）報道的從枯草芽孢桿菌發(fā)酵物中分離純化出的maltacines復(fù)合物，通過結(jié)構(gòu)初步鑒定其可能是fengycin的同系物，然而后期研究發(fā)現(xiàn)兩者在N端氨基酸存在明顯差別，因此初步認定其為一種新型的非核糖體合成抗菌肽，并且發(fā)現(xiàn)其對于真菌具有較強的抑制作用。另外還有親水性抗菌肽bacilysin，是一種分子量僅有270 Da的二肽，其N端為L-丙氨酸，C端為L-抗莢膜菌素，其中抗莢膜菌素在bacilysin表現(xiàn)抗菌功能時發(fā)揮了巨大作用，對多種細菌如金黃色葡萄球菌和真菌有抑制作用（Ozcengiz等，2015）。此外，還有其他非核糖體合成抗菌肽如rhizocticins 、amicoumacins 等（Bai等，2014）。2.2 核糖體合成抗菌肽 芽孢桿菌核糖體合成的抗菌肽通常被統(tǒng)稱為細菌素，是自然中廣泛存在的一類抗菌活性物質(zhì)。細菌素一般包括12～50個氨基酸殘基，陽離子型，雙親性或者疏水性。與乳酸菌屬產(chǎn)生的細菌素相比，芽孢桿菌屬產(chǎn)生的細菌素一般具有更寬的抑菌譜，通常對相近種屬的細菌抑菌性更強（Wang等，2014）。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生大量不同化學結(jié)構(gòu)的細菌素及其類似物，例如枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的subtilin，凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的coagulin，蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的 bacthuricin、thuricin、entomocin及 tochicin，蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的cerecin，地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的bacillocin。

細菌素根據(jù)芽孢桿菌屬前體在核糖體合成后是否經(jīng)過翻譯后修飾可以將其分為Class Ⅰ（modified）和 Class Ⅱ（unmodified）兩類，其中第二類又被分為5個亞類。而目前主要根據(jù)硫醚鍵殘基的結(jié)構(gòu)特性而將其分為常見羊毛硫抗生素和非常見羊毛硫抗生素兩大類。其中，羊毛硫抗生素一般分子量小于5 kD，主要由一些獨特氨基酸如脫氫酪氨酸、脫氫丙氨酸、羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等組成，分子內(nèi)絲氨酸和蘇氨酸通常與半胱氨酸巰基脫水形成硫醚鍵，常見羊毛硫抗生素一般又分為A型和B型兩類；非常見羊毛硫抗生素又因其分子量大小、熱穩(wěn)定性等特性不同而分為多個亞類（Bauer等，2005）。

2.2.1 A型羊毛硫抗生素 A型羊毛硫抗生素一般由21～38個氨基酸殘基組成，空間結(jié)構(gòu)一般為帶狀，含有陽離子和疏水肽，分子量小于5 kD，常見的包括subtilin、ericin等。其中subtilin及其衍生物subtilin B是一類由32個氨基酸殘基組成的五環(huán)羊毛硫抗生素，且結(jié)構(gòu)與細菌素Nisin具有60%以上的序列同源性（Bauer等，2005）。A型羊毛硫抗生素結(jié)構(gòu)中在3位和7位、8位和11位、13位和19位、23位和26位、25位和28位的脫二氧絲氨酸和脫二氧氨基丁酸殘基形成硫醚橋梁而構(gòu)成五個羊毛硫氨酸環(huán)，其中第一個和最后一個羊毛硫氨酸環(huán)結(jié)構(gòu)域具有雙親性。Fuchs等（2011）分離鑒定了一種來源于Bacillus subtilis DSM15029的同源性抗菌肽，與subtilin在結(jié)果上僅僅是6位、15位和24位的氨基酸殘基組成不同，其對多種革蘭氏陽性菌具有較高的抑制活性，而對于真菌等活性較低；研究發(fā)現(xiàn)subtilin及其部分衍生物對產(chǎn)單核細胞李斯特菌屬、肉毒桿菌屬等食品工業(yè)病原菌具有較高的活性，因此也被用作食品防腐劑（Scallan等，2011）。

Ericin屬于另一類A型羊毛硫抗生素，其主要來源于Bacillus subtilis A1/3菌株（Stein等，2002）。目前已有兩種Ericin被報道，分別為Ericin A 和 Ericin S，分子量為2986 Da和 3442 Da。其中Ericin S更近似于subtilin的衍生物，兩者在結(jié)構(gòu)上區(qū)別僅僅在6位、15位、24位和29位氨基酸的組成不同。而Ericin A 與Ericin S存在13個氨基酸的差異，同時在羊毛硫氨酸環(huán)和C端組成也存在結(jié)構(gòu)差異。Ericin A 和Ericin S抗微生物活性也存在區(qū)別，Ericin S 具有和subtilin相似的抗菌譜，主要對革蘭氏陽性菌有抑菌活性，而且其抑菌活性約為Ericin A 抑菌活性的100倍左右。

2.2.2 B型羊毛硫抗生素 B型羊毛硫抗生素大多是球形肽類，一般不帶電荷或者帶負電荷，具有疏水性，常見的如mersacidin，由20個氨基酸殘基組成，分子量為1825 Da，在1位和2位、4位和12位、13位和18位、15位和20位形成四個分子內(nèi)硫醚橋梁而構(gòu)成球形結(jié)構(gòu)（Szekat等，2003）。Mersacidin能夠作用于磷脂lipid Ⅱ而抑制細菌細胞壁的合成，對多種革蘭氏陽性菌如鏈球菌屬、葡萄球菌屬等具有抗菌活性，研究發(fā)現(xiàn)其對耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）具有良好的抑制作用（Kruszewska等，2004）。

2.2.3 非常見羊毛硫抗生素 非常見羊毛硫抗生素主要包括sublancin 和subtilosin A兩大類。其中sublancin是一種來源于Bacillus subtilis 168菌株由37個氨基酸殘基組成的新型羊毛硫類抗生素，其分子內(nèi)含有一個β-甲基化羊毛硫氨酸橋連結(jié)構(gòu)，分別為19位和22位之間形成的一個硫醚鍵以及7位和36位、14位和29位之間形成的兩個二硫鍵，最終構(gòu)成大環(huán)分子結(jié)構(gòu)。其抗菌譜與其他羊毛硫抗生素類似，對革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更有效，抗菌譜主要包括蠟樣芽孢桿菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等病原菌（Paik 等，1998）。

Subtilosin A也是最初來源于Bacillus subtilis 168或者Bacillus subtilis ATCC6633菌株的由35個氨基酸殘基組成的非常見羊毛硫抗生素，分子量為 3399.7 Da，分子內(nèi)的 4、7、13位半胱氨酸分別與31位的苯丙氨酸、28位的蘇氨酸、22位的苯丙氨酸縮合形成連接橋。此外，它在α碳端氨基酸殘基縮合構(gòu)成閉合環(huán)狀（Thennarasu等，2005）。Subtilosin A抗菌譜更廣，對包括產(chǎn)單核細胞李斯特菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等在內(nèi)的多種病原菌具有抗菌活性。

3 抗菌肽的作用機制

抗菌肽的作用機制主要為細胞膜損傷機制，即大多數(shù)陽離子型且具有雙親性或者疏水性的抗菌肽作用于細胞膜靶位點，形成膜孔通道，破壞細菌細胞結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致細胞質(zhì)外泄而殺滅細菌（Huang等，2009）。抗菌肽通過細胞膜損傷機理發(fā)揮抗菌作用主要包括三個階段帶正電荷的陽離子型抗菌肽與細菌細胞膜上帶負電荷的靶位點結(jié)合；形成膜孔通道，破壞細胞膜的完整性；在細菌細胞電動勢能作用下，引發(fā)細胞內(nèi)水溶性物質(zhì)的大量滲出，最終導(dǎo)致細菌死亡。此外，脂肽類抗菌肽的脂肪酸鏈有利于其發(fā)揮抑菌作用，比如伊枯草菌素家族結(jié)構(gòu)中的β-羥基脂肪酸鏈能夠通過重組細胞膜的磷脂雙分子層而發(fā)揮更好的抑菌活性，特別對于真菌類而言。

抗菌肽還可通過胞內(nèi)損傷機理發(fā)揮作用，即抗菌肽可以直接通過脯氨酸或者精氨酸的鉸鏈區(qū)在不改變細胞膜通透性的情況下直接穿過細胞膜，在胞內(nèi)蓄積后作用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成或翻譯等階段，進而抑制膜蛋白合成，破壞細胞膜完整性導(dǎo)致細菌細胞的損傷或者死亡。Lan等（2010）通過體外試驗發(fā)現(xiàn)抗菌肽Buforin可以在體外與大腸桿菌的DNA和RNA結(jié)合而改變它們的電泳遷移率，側(cè)面驗證抗菌肽與DNA等作用的可能性。Zhang等（2013）在研究解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens K103 產(chǎn)生的伊枯草菌素樣抗菌肽bacillomycin L時發(fā)現(xiàn)它除了具有形成細胞膜孔道的機制外還可以作用于真菌的DNA而造成其損傷。

此外，還有一些關(guān)于其他作用機制的報道。比如在研究surfactin家族一種新型抗菌肽WH1-fungin時發(fā)現(xiàn)其在發(fā)揮抑制真菌作用時存在兩種不同的現(xiàn)象，高濃度時能夠在細胞膜表面形成膜孔；而低濃度時則會誘導(dǎo)細胞的凋亡。同時該抗菌肽能夠與線粒體膜上的ATP酶結(jié)合而降低其生物活性（Qi等，2010）。Subtilosin作為一種陰離子抗菌肽，其作用機制與眾多陽離子抗菌肽存在差異，Noll等（2012）在研究subtilosin時發(fā)現(xiàn)其可以結(jié)合細菌細胞膜特異性靶位點直接作用于細胞膜，造成跨膜pH梯度發(fā)生變化，改變細菌的質(zhì)子動勢而引發(fā)胞內(nèi)ATP外流使細胞死亡。

4 展望

傳統(tǒng)飼用或人用抗生素耐藥性形勢嚴峻，迫使人們加快尋求抗生素替代品的步伐，無可否認某些天然活性物質(zhì)如抗菌肽具有潛在的可能性，特別是來源于芽孢桿菌的抗菌肽，因其廣譜抗菌能力以及較為高效的活性而備受關(guān)注。但是對于源自芽孢桿菌的抗菌肽而言，要真正的進入人類或者畜禽藥物等領(lǐng)域卻還需要更嚴謹?shù)睦碚摵蛯嵺`研究，比如在其作用機制、毒理學、免疫組學等方面。隨著一些新技術(shù)的出現(xiàn)，對于芽孢桿菌類抗菌肽研究也將日趨深入，特別是借助生物膜系統(tǒng)對其作用機制的研究以及更為有效的評估其細胞毒性作用等，這都會不斷加快芽孢桿菌類抗菌肽的研究進展及應(yīng)用。