氯胺酮對(duì)帕金森病小鼠模型α-突觸核蛋白表達(dá)的影響*

王丹丹， 宋俊杰， 慎曉飛， 洪道先， 韓 峰， 李會(huì)芳， 王 瑩

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科， 河南 開封 475000)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種好發(fā)于中老年人的進(jìn)行性、病因不明的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床癥狀以運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)步態(tài)不穩(wěn)、抑郁及睡眠障礙等為特征，病理顯示腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元減少[1-3]，殘存的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)含有不溶性淀粉樣蛋白α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)包涵體[4]，在基因突變和轉(zhuǎn)基因過表達(dá)α-syn的小鼠模型中均觀察到與PD疾病的密切相關(guān)性[5]。在臨床觀察的案例報(bào)告中發(fā)現(xiàn)，氯胺酮(ketamine,Ket)對(duì)帕金森病靜止性震顫癥狀具有快速抑制作用[6]；也有研究表明，氯胺酮不僅可以改善腦供血，還可以抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕應(yīng)激性激素和高代謝反應(yīng)等，通過多種途徑抑制小鼠腦中多巴胺能神經(jīng)元的丟失，提供神經(jīng)保護(hù)作用[7-8]；這些作用的產(chǎn)生可能與氯胺酮藥物本身高度的極化性、作用于JNK3通路以及NMDA受體功能有關(guān)[9-11]。但氯胺酮是否對(duì)帕金森病致病特征α-Syn的過表達(dá)及異常聚集產(chǎn)生影響未見報(bào)道。在嚙齒類動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)在給予低劑量(5～20 mg/kg)氯胺酮且分次注射時(shí)，產(chǎn)生了劑量依賴性增強(qiáng)的抗抑郁和抗運(yùn)動(dòng)功能障礙作用[12]；也有研究表明，給予亞麻醉劑量氯胺酮(8 mg/kg)時(shí)，觀察到PD小鼠黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)陽性神經(jīng)元表達(dá)增多、自噬增強(qiáng)、運(yùn)動(dòng)功能改善及神經(jīng)元保護(hù)作用的現(xiàn)象[13]。故本實(shí)驗(yàn)利用低劑量(25 mg/kg)的氯胺酮進(jìn)行研究，旨在初步探討氯胺酮對(duì)小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)α-Syn表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用氯胺酮治療帕金森病提供相關(guān)理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物及分組

采用SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠48只，鼠齡8～12周，體重 22～32 g，由北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部供應(yīng)，自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫(23±2)℃，自然光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)中小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照(NaCl)組、模型(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)組和治療(MPTP+Ket)組，各組分別給予不同的處理方式。

2 主要試劑

鹽酸氯胺酮注射劑(ketamine, Ket)由上海第一制藥廠提供；MPTP購自Sigma，使用生理鹽水配制20 g/L MPTP儲(chǔ)存液及2 g/L MPTP腹腔注射液；鼠抗TH單克隆抗體購自Abcam；鼠抗α-Syn單克隆抗體購自BD；鼠抗β-actin單克隆抗體和羊抗鼠Ⅱ抗購自康為世紀(jì)公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗購自Boster。

3 主要方法

3.1MPTP-PD小鼠模型制備及動(dòng)物給藥 腹腔內(nèi)注射神經(jīng)毒素MPTP能夠造成小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元和TH表達(dá)減少，并出現(xiàn)類似人類的運(yùn)動(dòng)功能障礙，是制備PD模型的常用方法[14-15]。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)均分為3組。MPTP+Ket組給予腹腔注射MPTP (25 mg/kg)，30 min后腹腔注射Ket (25 mg/kg)；MPTP組給予腹腔注射MPTP (25 mg/kg)，30 min后注射與Ket等體積的生理鹽水；NaCl組在同等時(shí)間給予腹腔注射與MPTP組等體積的生理鹽水。3組小鼠連續(xù)處理7 d。

3.2Rotarod實(shí)驗(yàn)檢測小鼠動(dòng)作協(xié)調(diào)和平衡能力 將預(yù)訓(xùn)練的小鼠置于轉(zhuǎn)桿上，開始爬行后自動(dòng)記錄轉(zhuǎn)桿滾動(dòng)圈數(shù)，至小鼠由轉(zhuǎn)桿掉下來為止。Rotarod實(shí)驗(yàn)采用非連續(xù)性測量法，測定2次，2次相隔時(shí)間1 h。

3.3Gait analysis system檢測小鼠步態(tài)的變化 將不透明跑道框(10 cm×10cm×50 cm)置于記錄紙上，跑道終點(diǎn)側(cè)2/3處有不透明頂蓋。將小鼠前爪用棉簽涂紅墨水標(biāo)記，后爪涂藍(lán)墨水標(biāo)記后放入跑道內(nèi)，對(duì)記錄紙上的后爪足跡進(jìn)行分析。每一次實(shí)驗(yàn)記錄開始后至少連續(xù)3步距離，測量連續(xù)的2個(gè)腳印點(diǎn)間距離及對(duì)側(cè)腳印點(diǎn)到該連線的垂直距離，即分別為步長和步寬。

3.4腦組織切片的制備 各組小鼠喂養(yǎng)1個(gè)月后，每組隨機(jī)取4只小鼠用于制作腦組織切片：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以戊巴比妥鈉(10 mg/kg)腹腔注射麻醉，依次灌注生理鹽水15 min 和多聚甲醛2 h。灌注完畢后迅速將小鼠置于冰上斷頭取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛中，4 ℃固定24 h。使用振蕩切片機(jī)將小鼠腦切至30 μm厚切片，置入0.1 mol/L PBS中-20 ℃保存。

3.5免疫組化染色檢測小鼠黑質(zhì)內(nèi)TH蛋白表達(dá)的變化 振蕩小鼠腦切片用0.2% Triton通透，10%山羊血清封閉后，加入鼠THⅠ抗(1∶500)室溫孵育4 h，加入Ⅱ抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，DAB染色5～10 min；75%～100%乙醇、乙醇-甲醇混合液(100%乙醇∶甲醇=1∶1)、甲醇梯度脫水，樹脂封片，成片于普通顯微鏡下觀察拍照。

3.6免疫熒光染色分析α-Syn的表達(dá) 振蕩小鼠腦切片用0.2% Triton通透，10%山羊血清室溫封閉后，加入鼠α-Syn Ⅰ抗(1∶500)室溫孵育4 h，加入Ⅱ抗(1∶1 000)，室溫避光孵育1 h，DAPI(1∶1 000)復(fù)染后于熒光顯微鏡下觀察拍照，表達(dá)的α-Syn被熒光Ⅱ抗標(biāo)記為紅色，熒光越強(qiáng)表明α-Syn的表達(dá)越多。

3.7Western blot 檢測α-Syn蛋白的表達(dá) 冠狀切出包含黑質(zhì)及紋狀體的腦組織，然后進(jìn)行勻漿裂解、離心，取上清，于-80 ℃保存，備用腦組織用于蛋白提取。SDS-PAGE分離提取的蛋白，每泳道總蛋白量200 μg。電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液封閉1.5 h。α-Syn Ⅰ抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，X線膠片曝光，顯影、定影。為了證實(shí)每個(gè)泳道總蛋白量相等，用剝脫液洗膜后，封閉液封閉1.5 h，以β-actin Ⅰ抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶4 000)室溫下孵育1 h，X線膠片曝光，顯影、定影。用天能化學(xué)發(fā)光掃描儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描。運(yùn)用Quantity One系統(tǒng)軟件分析條帶吸光度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 低劑量氯胺酮改善PD小鼠行為運(yùn)動(dòng)特征

與NaCl組比較，小鼠腹腔注射MPTP后，出現(xiàn)了明顯的姿勢(shì)步態(tài)不穩(wěn)、運(yùn)動(dòng)遲緩的癥狀,行為學(xué)測試結(jié)果顯示轉(zhuǎn)棒儀圈數(shù)減少,步距減小(P<0.05);與MPTP組比較，用低劑量氯胺酮處理后，PD小鼠姿勢(shì)步態(tài)不穩(wěn)、步距減少的癥狀得到明顯改善(P<0.05)。Rotarod實(shí)驗(yàn)與gait analysis system結(jié)果相符，MPTP+Ket組的數(shù)據(jù)均明顯優(yōu)于MPTP組，見表1。

表1Rotarod轉(zhuǎn)棒儀圈數(shù)與gaitanalysissystem步距結(jié)果

Table 1. The results of rotarod experiment and gait analysis system (Mean±SD.n=9)

GroupRotarod cycle Step length (cm)NaCl74.13±1.277.11±0.11MPTP45.46±1.11#6.75±0.05#MPTP+Ket66.77±1.93?7.09±0.08?

#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

2 低劑量氯胺酮具有神經(jīng)保護(hù)作用

MPTP腹腔注射造成小鼠的黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失。統(tǒng)計(jì)分析顯示，與NaCl組相比，MPTP組多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯減少(P<0.05);用低劑量氯胺酮處理后，MPTP+Ket組小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元增加，統(tǒng)計(jì)分析顯示，與MPTP組相比，MPTP+Ket組的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P<0.05),見圖1。

Figure 1. The changes of dopaminergic neurons in the substantia nigra (×10). Mean±SD.n=4.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

圖1小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目差異的比較

3 低劑量氯胺酮抑制小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn的異常表達(dá)

3.1低劑量氯胺酮抑制小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn異常表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示經(jīng)MPTP腹腔注射的小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)熒光強(qiáng)度較NaCl組明顯增強(qiáng)(P<0.05)，這表示MPTP組的α-Syn異常表達(dá)增多，與臨床病理結(jié)果相符；用低劑量氯胺酮處理后，PD小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)免疫熒光強(qiáng)度較MPTP組明顯減弱(P<0.05)，見圖2、3。

3.2低劑量氯胺酮抑制小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn蛋白表達(dá) Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NaCl組比較，經(jīng)MPTP腹腔注射的小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)；低劑量氯胺酮處理后，PD小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)的α-Syn表達(dá)量減少(P<0.05)，支持免疫組化的結(jié)果，見圖4。

討 論

隨著我國逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì)，PD患者將會(huì)急劇增長并長期維持在較高水平[16-17]。帕金森病患者生理指標(biāo)有多種改變[18]，但其病理特征表現(xiàn)為在殘存的神經(jīng)元胞體內(nèi)出現(xiàn)以α-Syn的包涵體和神經(jīng)突起[19]。目前認(rèn)為，α-Syn是 PD發(fā)病機(jī)制中一種重要的蛋白，在α-Syn突變、過度表達(dá)的野生型及氧化應(yīng)激等多種因素作用下，其異常聚集形成路易小體，并進(jìn)一步損害多巴胺神經(jīng)元[5, 20-21]，與PD的發(fā)病密切相關(guān)。因此，治療PD時(shí)，針對(duì)α-Syn異常聚集的干預(yù)顯得尤為重要。氯胺酮常作為全身麻醉藥物應(yīng)用于臨床，近年來臨床病例觀察和病例系統(tǒng)回顧發(fā)現(xiàn)[6, 22-23]，在應(yīng)用氯胺酮對(duì)帕金森病患者進(jìn)行麻醉時(shí)，可產(chǎn)生快速抑制帕金森病靜止性振顫的作用；體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也觀察到氯胺酮在多種帕金森病模型中均能產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，這種作用可能與改變大腦電活動(dòng)、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、NMDA受體及多種信號(hào)通路有關(guān)[12, 24-26]。但有關(guān)氯胺酮對(duì)帕金森病典型致病標(biāo)志α-Syn蛋白是否有影響卻鮮有報(bào)道，本論文目的為利用MPTP小鼠模型研究氯胺酮對(duì)PD小鼠α-Syn的影響，為了解氯胺酮治療帕金森病的可能性，指導(dǎo)臨床用藥。

Figure 2. The effect of low-dose ketamine (Ket) on the expression and abnormal accumulation of α-Syn (red) in the substantia nigra (×10). SNc: substantia nigra, compact part; SNr: substantia nigra, reticular part. Mean±SD.n=4.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

圖2低劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠黑質(zhì)區(qū)α-Syn表達(dá)的影響

Figure 3. The effect of low-dose ketamine (Ket) on the expression and abnormal accumulation of α-Syn (red) in the caudate putamen (CPu, ×4). Mean±SD.n=4.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

圖3低劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠紋狀體區(qū)α-Syn表達(dá)的影響

Figure 4. The results of Western blot. A: the protein expression of α-Syn in the substantia nigra; B: the protein expression of α-Syn in the CPu. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

圖4Westernblot檢測黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn的表達(dá)

PD模型有MPTP腹腔注射、6-OHDA和MPP+靶向注射等多種模型制備方式[15, 27-28]，神經(jīng)毒素 MPTP 腹腔注射 C57BL/6 小鼠被認(rèn)為是較操作簡單、制模理想的方法之一。本研究結(jié)果顯示，MPTP組與 NaCl組行為學(xué)、免疫組化TH染色、α-Syn蛋白免疫熒光染色及Western blot的結(jié)果均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，與前期文獻(xiàn)[29-31]研究結(jié)果一致，說明本實(shí)驗(yàn)用 MPTP 誘發(fā) C57BL/6 小鼠的PD復(fù)制方法簡單有效。在本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)給予低劑量氯胺酮腹腔注射后，MPTP+Ket組與MPTP組小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時(shí)間明顯延長，小鼠步距明顯增大，表明小劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠動(dòng)作的協(xié)調(diào)性、姿勢(shì)不穩(wěn)及步距減小的行為學(xué)癥狀得到明顯改善。免疫組化TH染色結(jié)果顯示，經(jīng)低劑量氯胺酮處理后MPTP+Ket組小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，這說明低劑量氯胺酮減輕了MPTP導(dǎo)致的黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的損傷。免疫熒光及Western blot檢測均提示MPTP可以誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)、紋狀體區(qū)的α-Syn表達(dá)增多，證實(shí)了α-Syn的異常表達(dá)可以產(chǎn)生帕金森病癥狀；但經(jīng)低劑量氯胺酮處理后，MPTP+Ket組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)熒光明顯減弱，表明α-Syn表達(dá)量減少，與此相應(yīng)PD小鼠的行為學(xué)癥狀改善相符合，表明低劑量氯胺酮干預(yù)可能是通過抑制α-Syn蛋白的過表達(dá)而改善帕金森病癥狀的，說明針對(duì)α-Syn的干預(yù)是有效的，但氯胺酮抑制α-Syn的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究重新探索了現(xiàn)已成熟應(yīng)用的臨床藥物氯胺酮在麻醉以外的治療應(yīng)用，從帕金森病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制——α-Syn異常聚集并損傷多巴胺神經(jīng)元——出發(fā)，發(fā)現(xiàn)氯胺酮對(duì)PD小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn異常表達(dá)具有抑制作用，并認(rèn)為通過改變?chǔ)?Syn的表達(dá)可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用氯胺酮治療帕金森病在一定程度上提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。