• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    氯胺酮對(duì)帕金森病小鼠模型α-突觸核蛋白表達(dá)的影響*

    2018-09-27 12:01:16王丹丹宋俊杰慎曉飛洪道先李會(huì)芳
    中國病理生理雜志 2018年9期
    關(guān)鍵詞:紋狀體黑質(zhì)氯胺酮

    王丹丹, 宋俊杰, 慎曉飛, 洪道先, 韓 峰, 李會(huì)芳, 王 瑩

    (河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科, 河南 開封 475000)

    帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種好發(fā)于中老年人的進(jìn)行性、病因不明的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床癥狀以運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)步態(tài)不穩(wěn)、抑郁及睡眠障礙等為特征,病理顯示腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元減少[1-3],殘存的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)含有不溶性淀粉樣蛋白α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)包涵體[4],在基因突變和轉(zhuǎn)基因過表達(dá)α-syn的小鼠模型中均觀察到與PD疾病的密切相關(guān)性[5]。在臨床觀察的案例報(bào)告中發(fā)現(xiàn),氯胺酮(ketamine,Ket)對(duì)帕金森病靜止性震顫癥狀具有快速抑制作用[6];也有研究表明,氯胺酮不僅可以改善腦供血,還可以抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),減輕應(yīng)激性激素和高代謝反應(yīng)等,通過多種途徑抑制小鼠腦中多巴胺能神經(jīng)元的丟失,提供神經(jīng)保護(hù)作用[7-8];這些作用的產(chǎn)生可能與氯胺酮藥物本身高度的極化性、作用于JNK3通路以及NMDA受體功能有關(guān)[9-11]。但氯胺酮是否對(duì)帕金森病致病特征α-Syn的過表達(dá)及異常聚集產(chǎn)生影響未見報(bào)道。在嚙齒類動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)在給予低劑量(5~20 mg/kg)氯胺酮且分次注射時(shí),產(chǎn)生了劑量依賴性增強(qiáng)的抗抑郁和抗運(yùn)動(dòng)功能障礙作用[12];也有研究表明,給予亞麻醉劑量氯胺酮(8 mg/kg)時(shí),觀察到PD小鼠黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)陽性神經(jīng)元表達(dá)增多、自噬增強(qiáng)、運(yùn)動(dòng)功能改善及神經(jīng)元保護(hù)作用的現(xiàn)象[13]。故本實(shí)驗(yàn)利用低劑量(25 mg/kg)的氯胺酮進(jìn)行研究,旨在初步探討氯胺酮對(duì)小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)α-Syn表達(dá)的影響,為臨床應(yīng)用氯胺酮治療帕金森病提供相關(guān)理論依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 動(dòng)物及分組

    采用SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠48只,鼠齡8~12周,體重 22~32 g,由北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部供應(yīng),自由進(jìn)食喂養(yǎng),室溫(23±2)℃,自然光照,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)中小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照(NaCl)組、模型(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)組和治療(MPTP+Ket)組,各組分別給予不同的處理方式。

    2 主要試劑

    鹽酸氯胺酮注射劑(ketamine, Ket)由上海第一制藥廠提供;MPTP購自Sigma,使用生理鹽水配制20 g/L MPTP儲(chǔ)存液及2 g/L MPTP腹腔注射液;鼠抗TH單克隆抗體購自Abcam;鼠抗α-Syn單克隆抗體購自BD;鼠抗β-actin單克隆抗體和羊抗鼠Ⅱ抗購自康為世紀(jì)公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗購自Boster。

    3 主要方法

    3.1MPTP-PD小鼠模型制備及動(dòng)物給藥 腹腔內(nèi)注射神經(jīng)毒素MPTP能夠造成小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元和TH表達(dá)減少,并出現(xiàn)類似人類的運(yùn)動(dòng)功能障礙,是制備PD模型的常用方法[14-15]。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)均分為3組。MPTP+Ket組給予腹腔注射MPTP (25 mg/kg),30 min后腹腔注射Ket (25 mg/kg);MPTP組給予腹腔注射MPTP (25 mg/kg),30 min后注射與Ket等體積的生理鹽水;NaCl組在同等時(shí)間給予腹腔注射與MPTP組等體積的生理鹽水。3組小鼠連續(xù)處理7 d。

    3.2Rotarod實(shí)驗(yàn)檢測小鼠動(dòng)作協(xié)調(diào)和平衡能力 將預(yù)訓(xùn)練的小鼠置于轉(zhuǎn)桿上,開始爬行后自動(dòng)記錄轉(zhuǎn)桿滾動(dòng)圈數(shù),至小鼠由轉(zhuǎn)桿掉下來為止。Rotarod實(shí)驗(yàn)采用非連續(xù)性測量法,測定2次,2次相隔時(shí)間1 h。

    3.3Gait analysis system檢測小鼠步態(tài)的變化 將不透明跑道框(10 cm×10cm×50 cm)置于記錄紙上,跑道終點(diǎn)側(cè)2/3處有不透明頂蓋。將小鼠前爪用棉簽涂紅墨水標(biāo)記,后爪涂藍(lán)墨水標(biāo)記后放入跑道內(nèi),對(duì)記錄紙上的后爪足跡進(jìn)行分析。每一次實(shí)驗(yàn)記錄開始后至少連續(xù)3步距離,測量連續(xù)的2個(gè)腳印點(diǎn)間距離及對(duì)側(cè)腳印點(diǎn)到該連線的垂直距離,即分別為步長和步寬。

    3.4腦組織切片的制備 各組小鼠喂養(yǎng)1個(gè)月后,每組隨機(jī)取4只小鼠用于制作腦組織切片:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以戊巴比妥鈉(10 mg/kg)腹腔注射麻醉,依次灌注生理鹽水15 min 和多聚甲醛2 h。灌注完畢后迅速將小鼠置于冰上斷頭取腦,將腦組織置于4%多聚甲醛中,4 ℃固定24 h。使用振蕩切片機(jī)將小鼠腦切至30 μm厚切片,置入0.1 mol/L PBS中-20 ℃保存。

    3.5免疫組化染色檢測小鼠黑質(zhì)內(nèi)TH蛋白表達(dá)的變化 振蕩小鼠腦切片用0.2% Triton通透,10%山羊血清封閉后,加入鼠THⅠ抗(1∶500)室溫孵育4 h,加入Ⅱ抗(1∶1 000),室溫孵育1 h,DAB染色5~10 min;75%~100%乙醇、乙醇-甲醇混合液(100%乙醇∶甲醇=1∶1)、甲醇梯度脫水,樹脂封片,成片于普通顯微鏡下觀察拍照。

    3.6免疫熒光染色分析α-Syn的表達(dá) 振蕩小鼠腦切片用0.2% Triton通透,10%山羊血清室溫封閉后,加入鼠α-Syn Ⅰ抗(1∶500)室溫孵育4 h,加入Ⅱ抗(1∶1 000),室溫避光孵育1 h,DAPI(1∶1 000)復(fù)染后于熒光顯微鏡下觀察拍照,表達(dá)的α-Syn被熒光Ⅱ抗標(biāo)記為紅色,熒光越強(qiáng)表明α-Syn的表達(dá)越多。

    3.7Western blot 檢測α-Syn蛋白的表達(dá) 冠狀切出包含黑質(zhì)及紋狀體的腦組織,然后進(jìn)行勻漿裂解、離心,取上清,于-80 ℃保存,備用腦組織用于蛋白提取。SDS-PAGE分離提取的蛋白,每泳道總蛋白量200 μg。電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉液封閉1.5 h。α-Syn Ⅰ抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜,HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶4 000)室溫孵育1 h,X線膠片曝光,顯影、定影。為了證實(shí)每個(gè)泳道總蛋白量相等,用剝脫液洗膜后,封閉液封閉1.5 h,以β-actin Ⅰ抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜,HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶4 000)室溫下孵育1 h,X線膠片曝光,顯影、定影。用天能化學(xué)發(fā)光掃描儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描。運(yùn)用Quantity One系統(tǒng)軟件分析條帶吸光度。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析,采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 低劑量氯胺酮改善PD小鼠行為運(yùn)動(dòng)特征

    與NaCl組比較,小鼠腹腔注射MPTP后,出現(xiàn)了明顯的姿勢(shì)步態(tài)不穩(wěn)、運(yùn)動(dòng)遲緩的癥狀,行為學(xué)測試結(jié)果顯示轉(zhuǎn)棒儀圈數(shù)減少,步距減小(P<0.05);與MPTP組比較,用低劑量氯胺酮處理后,PD小鼠姿勢(shì)步態(tài)不穩(wěn)、步距減少的癥狀得到明顯改善(P<0.05)。Rotarod實(shí)驗(yàn)與gait analysis system結(jié)果相符,MPTP+Ket組的數(shù)據(jù)均明顯優(yōu)于MPTP組,見表1。

    表1Rotarod轉(zhuǎn)棒儀圈數(shù)與gaitanalysissystem步距結(jié)果

    Table 1. The results of rotarod experiment and gait analysis system (Mean±SD.n=9)

    GroupRotarod cycle Step length (cm)NaCl74.13±1.277.11±0.11MPTP45.46±1.11#6.75±0.05#MPTP+Ket66.77±1.93?7.09±0.08?

    #P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    2 低劑量氯胺酮具有神經(jīng)保護(hù)作用

    MPTP腹腔注射造成小鼠的黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失。統(tǒng)計(jì)分析顯示,與NaCl組相比,MPTP組多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯減少(P<0.05);用低劑量氯胺酮處理后,MPTP+Ket組小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元增加,統(tǒng)計(jì)分析顯示,與MPTP組相比,MPTP+Ket組的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P<0.05),見圖1。

    Figure 1. The changes of dopaminergic neurons in the substantia nigra (×10). Mean±SD.n=4.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    圖1小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目差異的比較

    3 低劑量氯胺酮抑制小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn的異常表達(dá)

    3.1低劑量氯胺酮抑制小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn異常表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示經(jīng)MPTP腹腔注射的小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)熒光強(qiáng)度較NaCl組明顯增強(qiáng)(P<0.05),這表示MPTP組的α-Syn異常表達(dá)增多,與臨床病理結(jié)果相符;用低劑量氯胺酮處理后,PD小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)免疫熒光強(qiáng)度較MPTP組明顯減弱(P<0.05),見圖2、3。

    3.2低劑量氯胺酮抑制小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn蛋白表達(dá) Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NaCl組比較,經(jīng)MPTP腹腔注射的小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn的表達(dá)量明顯增加(P<0.05);低劑量氯胺酮處理后,PD小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)的α-Syn表達(dá)量減少(P<0.05),支持免疫組化的結(jié)果,見圖4。

    討 論

    隨著我國逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì),PD患者將會(huì)急劇增長并長期維持在較高水平[16-17]。帕金森病患者生理指標(biāo)有多種改變[18],但其病理特征表現(xiàn)為在殘存的神經(jīng)元胞體內(nèi)出現(xiàn)以α-Syn的包涵體和神經(jīng)突起[19]。目前認(rèn)為,α-Syn是 PD發(fā)病機(jī)制中一種重要的蛋白,在α-Syn突變、過度表達(dá)的野生型及氧化應(yīng)激等多種因素作用下,其異常聚集形成路易小體,并進(jìn)一步損害多巴胺神經(jīng)元[5, 20-21],與PD的發(fā)病密切相關(guān)。因此,治療PD時(shí),針對(duì)α-Syn異常聚集的干預(yù)顯得尤為重要。氯胺酮常作為全身麻醉藥物應(yīng)用于臨床,近年來臨床病例觀察和病例系統(tǒng)回顧發(fā)現(xiàn)[6, 22-23],在應(yīng)用氯胺酮對(duì)帕金森病患者進(jìn)行麻醉時(shí),可產(chǎn)生快速抑制帕金森病靜止性振顫的作用;體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也觀察到氯胺酮在多種帕金森病模型中均能產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用,這種作用可能與改變大腦電活動(dòng)、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、NMDA受體及多種信號(hào)通路有關(guān)[12, 24-26]。但有關(guān)氯胺酮對(duì)帕金森病典型致病標(biāo)志α-Syn蛋白是否有影響卻鮮有報(bào)道,本論文目的為利用MPTP小鼠模型研究氯胺酮對(duì)PD小鼠α-Syn的影響,為了解氯胺酮治療帕金森病的可能性,指導(dǎo)臨床用藥。

    Figure 2. The effect of low-dose ketamine (Ket) on the expression and abnormal accumulation of α-Syn (red) in the substantia nigra (×10). SNc: substantia nigra, compact part; SNr: substantia nigra, reticular part. Mean±SD.n=4.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    圖2低劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠黑質(zhì)區(qū)α-Syn表達(dá)的影響

    Figure 3. The effect of low-dose ketamine (Ket) on the expression and abnormal accumulation of α-Syn (red) in the caudate putamen (CPu, ×4). Mean±SD.n=4.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    圖3低劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠紋狀體區(qū)α-Syn表達(dá)的影響

    Figure 4. The results of Western blot. A: the protein expression of α-Syn in the substantia nigra; B: the protein expression of α-Syn in the CPu. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    圖4Westernblot檢測黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn的表達(dá)

    PD模型有MPTP腹腔注射、6-OHDA和MPP+靶向注射等多種模型制備方式[15, 27-28],神經(jīng)毒素 MPTP 腹腔注射 C57BL/6 小鼠被認(rèn)為是較操作簡單、制模理想的方法之一。本研究結(jié)果顯示,MPTP組與 NaCl組行為學(xué)、免疫組化TH染色、α-Syn蛋白免疫熒光染色及Western blot的結(jié)果均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,與前期文獻(xiàn)[29-31]研究結(jié)果一致,說明本實(shí)驗(yàn)用 MPTP 誘發(fā) C57BL/6 小鼠的PD復(fù)制方法簡單有效。在本實(shí)驗(yàn)中,連續(xù)給予低劑量氯胺酮腹腔注射后,MPTP+Ket組與MPTP組小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時(shí)間明顯延長,小鼠步距明顯增大,表明小劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠動(dòng)作的協(xié)調(diào)性、姿勢(shì)不穩(wěn)及步距減小的行為學(xué)癥狀得到明顯改善。免疫組化TH染色結(jié)果顯示,經(jīng)低劑量氯胺酮處理后MPTP+Ket組小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯增多,這說明低劑量氯胺酮減輕了MPTP導(dǎo)致的黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的損傷。免疫熒光及Western blot檢測均提示MPTP可以誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)、紋狀體區(qū)的α-Syn表達(dá)增多,證實(shí)了α-Syn的異常表達(dá)可以產(chǎn)生帕金森病癥狀;但經(jīng)低劑量氯胺酮處理后,MPTP+Ket組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)熒光明顯減弱,表明α-Syn表達(dá)量減少,與此相應(yīng)PD小鼠的行為學(xué)癥狀改善相符合,表明低劑量氯胺酮干預(yù)可能是通過抑制α-Syn蛋白的過表達(dá)而改善帕金森病癥狀的,說明針對(duì)α-Syn的干預(yù)是有效的,但氯胺酮抑制α-Syn的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,本研究重新探索了現(xiàn)已成熟應(yīng)用的臨床藥物氯胺酮在麻醉以外的治療應(yīng)用,從帕金森病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制——α-Syn異常聚集并損傷多巴胺神經(jīng)元——出發(fā),發(fā)現(xiàn)氯胺酮對(duì)PD小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn異常表達(dá)具有抑制作用,并認(rèn)為通過改變?chǔ)?Syn的表達(dá)可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用,為臨床應(yīng)用氯胺酮治療帕金森病在一定程度上提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    紋狀體黑質(zhì)氯胺酮
    帕金森病模型大鼠黑質(zhì)磁共振ESWAN序列R2*值與酪氨酸羥化酶表達(dá)相關(guān)性的研究
    氯胺酮及其異構(gòu)體和代謝物抗抑郁研究進(jìn)展☆
    帕金森病患者黑質(zhì)的磁共振成像研究進(jìn)展
    紋狀體A2AR和D2DR對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)過程中蒼白球GABA和Glu釋放的調(diào)控研究
    紋狀體內(nèi)移植胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)前體細(xì)胞可升高帕金森病小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺含量
    氯胺酮對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響
    氯胺酮聯(lián)合丙泊酚在小兒麻醉中的應(yīng)用效果觀察
    1H-MRS檢測早期帕金森病紋狀體、黑質(zhì)的功能代謝
    磁共振成像(2015年7期)2015-12-23 08:53:04
    補(bǔ)腎活血顆粒對(duì)帕金森病模型大鼠黑質(zhì)紋狀體bcl-2、bax表達(dá)的影響
    氯胺酮依賴腦內(nèi)作用靶點(diǎn)的可視化研究
    同位素(2014年2期)2014-04-16 04:57:16
    国产精品香港三级国产av潘金莲| 一级,二级,三级黄色视频| 国产一区在线观看成人免费| 悠悠久久av| 精品电影一区二区在线| 搡老岳熟女国产| 在线观看一区二区三区激情| 美女大奶头视频| 黄片小视频在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲五月天丁香| 午夜福利在线免费观看网站| 国产成人精品无人区| 久久午夜亚洲精品久久| 99在线人妻在线中文字幕| 99精品欧美一区二区三区四区| 日韩视频一区二区在线观看| 国产精品成人在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品免费视频内射| 久久国产精品影院| 午夜视频精品福利| 男女下面进入的视频免费午夜 | 美女大奶头视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩av在线大香蕉| 夜夜夜夜夜久久久久| √禁漫天堂资源中文www| 怎么达到女性高潮| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩免费av在线播放| 精品一区二区三卡| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲avbb在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 丁香欧美五月| 亚洲av电影在线进入| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品久久蜜臀av无| 日日夜夜操网爽| www日本在线高清视频| 麻豆久久精品国产亚洲av | 在线观看免费午夜福利视频| 久久伊人香网站| 精品高清国产在线一区| 国产99白浆流出| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久香蕉国产精品| 久久性视频一级片| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲av片天天在线观看| 999精品在线视频| 天天影视国产精品| 国产免费现黄频在线看| tocl精华| 久久伊人香网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 男女下面进入的视频免费午夜 | 久久九九热精品免费| 免费在线观看亚洲国产| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 91精品国产国语对白视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 高清欧美精品videossex| 色播在线永久视频| 麻豆国产av国片精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲一区中文字幕在线| 麻豆一二三区av精品| 怎么达到女性高潮| 亚洲在线自拍视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产高清videossex| www.熟女人妻精品国产| www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久性视频一级片| www.自偷自拍.com| 色综合婷婷激情| 国产成人啪精品午夜网站| www.www免费av| 免费av毛片视频| 在线观看66精品国产| 无限看片的www在线观看| 校园春色视频在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| av片东京热男人的天堂| 亚洲人成电影观看| cao死你这个sao货| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲片人在线观看| 搡老岳熟女国产| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产视频一区二区在线看| 人人澡人人妻人| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲中文av在线| 男女床上黄色一级片免费看| 精品国产美女av久久久久小说| 国产在线观看jvid| 色在线成人网| www.自偷自拍.com| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜激情av网站| 最好的美女福利视频网| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费高清在线观看日韩| 日韩欧美在线二视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 99在线人妻在线中文字幕| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品久久久久久电影网| 精品久久久精品久久久| 波多野结衣高清无吗| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久国产一区二区| 亚洲av片天天在线观看| 国产三级在线视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产色视频综合| 日韩欧美在线二视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 91成人精品电影| 色综合站精品国产| 久久九九热精品免费| www.精华液| 欧美精品啪啪一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 成人国语在线视频| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 在线观看免费视频网站a站| 淫秽高清视频在线观看| 成年人黄色毛片网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品国产国语对白av| 亚洲精品国产区一区二| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 高清在线国产一区| 一区二区三区精品91| 国产成人精品久久二区二区91| 日韩欧美免费精品| 免费在线观看完整版高清| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产三级黄色录像| 欧美激情极品国产一区二区三区| 色综合站精品国产| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲熟妇熟女久久| 黑丝袜美女国产一区| 国产免费av片在线观看野外av| 高清av免费在线| 久久精品成人免费网站| 久久亚洲真实| 桃红色精品国产亚洲av| 午夜精品久久久久久毛片777| tocl精华| 国产国语露脸激情在线看| 午夜老司机福利片| 亚洲欧美激情综合另类| 国产97色在线日韩免费| 国产成人av激情在线播放| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品一区二区在线不卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 一级毛片女人18水好多| 久久精品91蜜桃| 精品人妻在线不人妻| 色在线成人网| www.自偷自拍.com| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 性少妇av在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品九九99| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲熟女毛片儿| 9热在线视频观看99| 亚洲欧美激情在线| 日韩精品中文字幕看吧| 91九色精品人成在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久久久九九精品影院| 色婷婷av一区二区三区视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99国产精品一区二区三区| 国产一区二区三区视频了| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 天堂√8在线中文| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲人成电影免费在线| 午夜久久久在线观看| 久久热在线av| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲熟女毛片儿| 黄色女人牲交| 免费搜索国产男女视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲熟妇熟女久久| 在线观看日韩欧美| 怎么达到女性高潮| 国产精品综合久久久久久久免费 | 热99国产精品久久久久久7| 日本欧美视频一区| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲人成77777在线视频| 色尼玛亚洲综合影院| 97碰自拍视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 99国产精品免费福利视频| 一级片'在线观看视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 十八禁人妻一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 一级黄色大片毛片| 国产有黄有色有爽视频| 99国产精品99久久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 级片在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美日韩一级在线毛片| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 在线观看免费高清a一片| 黄色女人牲交| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲精品在线美女| cao死你这个sao货| 老司机深夜福利视频在线观看| www.999成人在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 黄色 视频免费看| 夜夜爽天天搞| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 很黄的视频免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 99国产精品免费福利视频| 午夜久久久在线观看| 国产av在哪里看| 欧美日韩视频精品一区| 欧美成人午夜精品| 国产成人精品久久二区二区91| 国产成人精品久久二区二区免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美午夜高清在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 好男人电影高清在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 日韩有码中文字幕| 欧美一区二区精品小视频在线| av超薄肉色丝袜交足视频| 香蕉久久夜色| 午夜福利在线免费观看网站| 看片在线看免费视频| 国产av一区二区精品久久| 久久久久国内视频| 精品久久蜜臀av无| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲avbb在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 十八禁人妻一区二区| 国产精品国产高清国产av| 99国产综合亚洲精品| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 精品日产1卡2卡| 91成人精品电影| 99久久国产精品久久久| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲人成电影观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 免费高清在线观看日韩| 亚洲国产欧美网| 精品乱码久久久久久99久播| 国产人伦9x9x在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产成人系列免费观看| 少妇的丰满在线观看| 日本五十路高清| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久香蕉精品热| 亚洲五月天丁香| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲情色 制服丝袜| 国产免费av片在线观看野外av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 岛国在线观看网站| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品久久久av美女十八| 精品一区二区三区四区五区乱码| ponron亚洲| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲色图av天堂| 高清黄色对白视频在线免费看| 美国免费a级毛片| 亚洲人成77777在线视频| 99精品在免费线老司机午夜| 国产午夜精品久久久久久| 欧美中文综合在线视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久国产精品影院| 一级片免费观看大全| 一本综合久久免费| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品一区二区在线不卡| 两个人免费观看高清视频| 国产97色在线日韩免费| 亚洲少妇的诱惑av| 精品久久久久久电影网| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 真人一进一出gif抽搐免费| 热99国产精品久久久久久7| 91成年电影在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 久热这里只有精品99| 精品久久蜜臀av无| 亚洲美女黄片视频| 免费不卡黄色视频| 国产精品影院久久| 久99久视频精品免费| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产成人精品无人区| 色播在线永久视频| 久久久精品欧美日韩精品| 免费在线观看日本一区| 99热只有精品国产| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 天天影视国产精品| 欧美一级毛片孕妇| 国产野战对白在线观看| 久久香蕉激情| 999精品在线视频| 在线观看午夜福利视频| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品国产国语对白av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产单亲对白刺激| 精品久久久久久,| x7x7x7水蜜桃| av天堂在线播放| 两性夫妻黄色片| 亚洲中文字幕日韩| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产av精品麻豆| 国产激情欧美一区二区| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产xxxxx性猛交| aaaaa片日本免费| 午夜精品国产一区二区电影| 一进一出抽搐动态| 好男人电影高清在线观看| 视频区图区小说| 亚洲伊人色综图| 亚洲免费av在线视频| 亚洲自拍偷在线| 中出人妻视频一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美大码av| 亚洲成人国产一区在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲av成人一区二区三| 久久久国产精品麻豆| 午夜91福利影院| 国产有黄有色有爽视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲精品一区av在线观看| 成年版毛片免费区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲| а√天堂www在线а√下载| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99国产综合亚洲精品| 中出人妻视频一区二区| 亚洲中文字幕日韩| 午夜福利欧美成人| 这个男人来自地球电影免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 两个人免费观看高清视频| 成人国语在线视频| 好男人电影高清在线观看| 91国产中文字幕| 一级黄色大片毛片| 亚洲av熟女| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久久久久午夜电影 | 国产精品影院久久| 涩涩av久久男人的天堂| 久久久水蜜桃国产精品网| 一二三四社区在线视频社区8| 日韩av在线大香蕉| 操美女的视频在线观看| 中文字幕高清在线视频| 黄色 视频免费看| av有码第一页| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美色视频一区免费| 亚洲精品成人av观看孕妇| 一夜夜www| 91在线观看av| 天堂√8在线中文| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 美女国产高潮福利片在线看| 丰满的人妻完整版| 99香蕉大伊视频| 女同久久另类99精品国产91| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 香蕉国产在线看| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 无人区码免费观看不卡| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 香蕉丝袜av| 成人精品一区二区免费| 久热这里只有精品99| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲avbb在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲中文av在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久国产欧美日韩av| 女警被强在线播放| 国产av在哪里看| 亚洲avbb在线观看| 99国产精品免费福利视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 999精品在线视频| x7x7x7水蜜桃| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久人妻av系列| 啦啦啦 在线观看视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久精品91无色码中文字幕| 免费在线观看影片大全网站| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品久久久人人做人人爽| 脱女人内裤的视频| 一夜夜www| 国产视频一区二区在线看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一级a爱片免费观看的视频| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲久久久国产精品| 久久精品国产综合久久久| 久久亚洲真实| 亚洲全国av大片| 欧美成人免费av一区二区三区| 宅男免费午夜| 久久久久久久久免费视频了| 欧美黑人欧美精品刺激| xxx96com| 久久亚洲精品不卡| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲精品在线美女| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 成熟少妇高潮喷水视频| 超碰97精品在线观看| 极品教师在线免费播放| 午夜久久久在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 51午夜福利影视在线观看| 9色porny在线观看| 免费少妇av软件| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 男女之事视频高清在线观看| 免费观看精品视频网站| 久久香蕉国产精品| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 日本三级黄在线观看| 久久香蕉国产精品| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产在线精品亚洲第一网站| 黄频高清免费视频| 成人特级黄色片久久久久久久| e午夜精品久久久久久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 99国产精品99久久久久| 麻豆av在线久日| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产片内射在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| a级毛片黄视频| 欧美日韩一级在线毛片| 国产真人三级小视频在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载| 国产99白浆流出| 大码成人一级视频| 88av欧美| 女性被躁到高潮视频| 久9热在线精品视频| 欧美在线黄色| 99精品在免费线老司机午夜| 69av精品久久久久久| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 成人亚洲精品av一区二区 | 大香蕉久久成人网| 成年版毛片免费区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 精品高清国产在线一区| 99在线人妻在线中文字幕| 9色porny在线观看| 18禁国产床啪视频网站| av网站在线播放免费| 天天影视国产精品| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产亚洲精品第一综合不卡| 十分钟在线观看高清视频www| 神马国产精品三级电影在线观看 | 成人国产一区最新在线观看| 成人18禁在线播放| 极品教师在线免费播放| 热re99久久精品国产66热6| 色综合欧美亚洲国产小说| 91精品三级在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲午夜理论影院| 久久精品成人免费网站| 97碰自拍视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 一区二区三区激情视频| 99久久综合精品五月天人人| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品无人区乱码1区二区| 免费在线观看完整版高清| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精华一区二区三区| 国产成人系列免费观看| 一级毛片精品| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日韩大尺度精品在线看网址 | 成人影院久久| 欧美日韩乱码在线| 身体一侧抽搐| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品av久久久久免费| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 色综合站精品国产| 动漫黄色视频在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美一区二区精品小视频在线| 99久久国产精品久久久| 免费看a级黄色片| 老司机福利观看| 久久亚洲精品不卡| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 日本五十路高清|