黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響*

潘宋斌， 萬 琳， 邵 衛(wèi)， 唐 坤， 姚漢云

(1武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 武漢 430022; 2武漢市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 武漢 430014)

腦缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)是指腦部血供中斷后，重新開通閉塞血管及恢復(fù)大腦血供后造成的腦組織損傷，其對人類的危害僅次于腫瘤和心臟疾病，是人類致死和致殘的重要原因之一[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)IRI發(fā)病機制可能為腦血供受阻中斷后，引起腦組織細胞發(fā)生缺氧缺血，而恢復(fù)大腦血供后可進一步誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)、氧自由基產(chǎn)生增多及細胞凋亡，因此有效抑制炎癥反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激和細胞凋亡是減輕腦IRI的有效途徑[3]。Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator transcription 3，JAK2/STAT3)信號通路是一條重要的炎癥反應(yīng)相關(guān)通路，在腦IRI的發(fā)病機制中具有重要作用[4-5]。黃角顆粒由大黃和水牛角2味中藥組成，具有通腑泄熱和涼血解毒的功效，已有研究證實其對于腦梗死的治療作用顯著[6-7]。本研究構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，探討黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷的作用及其潛在機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠共30只，體重(230±20) g， 8～9周齡，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，動物許可證號為SCXK(鄂)2015-0018，給予標準飼料在12 h明暗交替環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水。

2 主要試劑與儀器

黃角顆粒由武漢市第一醫(yī)院制劑科提供，大黃和水牛角破壁粉劑按1∶2比例配制，用蒸餾水稀釋為100%溶液備用(即含生藥1 kg/L)。兔抗人p-JAK2多克隆抗體(貨號ab195055；稀釋比1∶1 000)、兔抗人p-STAT3單克隆抗體(貨號ab76315；稀釋比1∶200 000)、兔抗人β-actin多克隆抗體(貨號ab8227；稀釋比1∶2 000)和山羊抗兔II抗(貨號ab6721；稀釋比1∶2 000)均購自Abcam；TUNEL檢測試劑盒購于武漢博士德公司； 氯化2，3，5-三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)購自Sigma。

高速離心機購自Eppendorf；電泳儀購自Bio-Rad；石蠟包埋機和石蠟連續(xù)切片機購自德國徠卡公司；攤片烤片機購自湖北康強醫(yī)療器械有限公司；光學(xué)顯微鏡及顯微鏡成相分析系統(tǒng)購自O(shè)lympus。

3 方法

3.1動物模型的構(gòu)建 參考Zea Longa的方法建立大鼠左側(cè)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型[8-9],具體方法如下：大鼠術(shù)前禁食24 h，自由飲水，大鼠稱重，用10%水合氯醛以3.5 mL/kg進行腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)備皮進行常規(guī)消毒，取頸部正中縱切口，長約2 cm，依次暴露頜下腺、胸鎖乳突肌和肩胛舌骨肌，分別用自制小拉鉤拉向兩旁進行固定，選取左側(cè)大腦中動脈作為缺血側(cè)，右側(cè)為正常對照。分離左側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)及其分支甲狀腺上動脈和枕動脈、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)及其分支翼腭動脈(pterygopalatine artery，PPA)，結(jié)扎ECA及其分支甲狀腺上動脈和枕動脈，隨后用顯微動脈夾分別夾住ICA和CCA，用顯微手術(shù)剪刀在ECA斷端距動脈分叉3 mm處的動脈壁上側(cè)切小口，將尼龍魚線插入，調(diào)整線栓走向使其與ICA近一直線，移去ICA的顯微動脈夾，線栓至ICA顱內(nèi)段時緩慢推進，遇輕微阻力即停止推進，此時線栓插入深度約20 mm(從CCA分叉處計算，若誤入翼腭動脈中線栓插入15 mm長度即有阻力，不能繼續(xù)插入)，即可阻斷大腦中動脈，引起左側(cè)MCAO。然后扎緊ECA，觀察無出血后縫合皮膚。缺血2 h后再灌注，將尼龍魚線抽出，使其頭端退回到ECA主干內(nèi)，恢復(fù)左側(cè)大腦中動脈供血。將麻醉蘇醒后的大鼠放回鼠籠進行單籠飼養(yǎng)，讓其自由飲食。假手術(shù)組除不插魚線閉塞大腦中動脈之外，其余步驟同造模組。術(shù)中需保持室內(nèi)溫度為25 ℃。

3.2實驗分組 將大鼠分為假手術(shù)(sham operation)組、腦缺血再灌注模型(model)組和黃角顆粒(Huangjiao granule)組，每組10只。假手術(shù)組大鼠僅切開頸部皮膚，暴露左側(cè)頸總動脈；腦缺血再灌注模型組大鼠在缺血再灌注前30 min給予10 mL/kg的生理鹽水進行腹腔注射；黃角顆粒組大鼠在缺血再灌注前30 min給予10 mL/kg的黃角顆粒溶液(生藥含量1 kg/L)進行腹腔注射。

3.3神經(jīng)功能評分 各組大鼠缺血再灌注24 h后觀察其神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，主要觀察大鼠肢體癱瘓和轉(zhuǎn)圈等情況，并作提尾懸空試驗，剔除有痙攣和意識障礙的大鼠。參考經(jīng)典的MACO模型神經(jīng)功能評分(Zea Longa評分法)標準[9]：無神經(jīng)損傷癥狀為0 分；不能完全伸展對側(cè)前爪為1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分；向?qū)?cè)傾斜為3分;不能自發(fā)行走，意識喪失為4分。

3.4TTC染色觀察大鼠腦梗死百分比 各組大鼠缺血再灌注24 h后，于冰上快速斷頭處死，取出其腦組織于-80 ℃冰箱中冷凍3～5 min后，自額極向后冠狀面切成2 mm厚的切片。將切片浸泡在1% TTC溶液中，嚴格避光條件下37 ℃恒溫孵育約30 min，每隔5 min翻動一次腦組織切片，染色成功后，正常腦組織為紅色，梗死腦組織為白色。將染色成功的腦切片移至黑色紙板上，按由前至后的順序排列，用數(shù)碼相機拍照，輸入計算機，圖像經(jīng)過專業(yè)圖像分析軟件IPP 6.0處理并分析，計算大鼠腦梗死體積百分比，計算公式為：腦梗死體積百分比(%)=腦梗死體積/(腦梗死體積+腦非梗死體積)×100%。

3.5HE染色 各組大鼠缺血再灌注24 h后，于冰上快速斷頭處死，在冰盤上取出腦組織，用10%甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后進行石蠟包埋，制成石蠟切片。冠狀切片，片厚4 μm，進行HE染色。

3.6TUNEL法檢測各組大鼠腦細胞凋亡 將制好的石蠟切片進行TUNEL染色檢測各組大鼠腦細胞凋亡，方法步驟按照TUNEL檢測試劑盒說明書進行。每張病理切片隨機選取不交叉重復(fù)的5個視野在光學(xué)顯微鏡下進行觀察，呈現(xiàn)棕黃色的細胞為凋亡細胞，取5個視野的凋亡細胞平均值作為該樣本的凋亡細胞數(shù)。腦細胞凋亡率(%)=凋亡細胞/總細胞×100%。

3.7Western blot檢測p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平 將保存于-80 ℃的各組腦組織各取100 mg左右提取組織蛋白，采用RIPA裂解液提取各組腦組織的組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣30 μL蛋白樣品，采用12%的SDS-PAGE進行分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉進行室溫封閉1 h，經(jīng)TBST洗滌后加入相應(yīng)的 I 抗在4 ℃下孵育過夜，TBST再次洗滌后，加入特異性 II 抗，進行室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光試劑對其曝光顯影，拍照保存。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析均采用SPSS 19.0軟件進行。實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃角顆粒對大鼠神經(jīng)功能評分的影響

假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損，其蘇醒后可正常活動；模型組大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，其蘇醒后均出現(xiàn)肢體活動障礙；黃角顆粒組大鼠蘇醒后出現(xiàn)輕微的肢體活動障礙。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的神經(jīng)功能缺損程度出現(xiàn)明顯加重(P<0.05)；與模型組相比，黃角顆粒組大鼠的神經(jīng)功能缺損程度明顯減輕，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1各組大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積百分比和腦細胞凋亡率

Table 1. The neurological function scores, the percentage of cerebral infarction volume and cell apoptotic rate of brain were measured in rats (Mean±SD.n=10)

GroupThe neurological function scoreThe percentage of cerebral infarction volume (%)Cell apoptotic rate of brain (%)Sham operation005.85±0.83Model2.87±0.65?31.38±3.53?65.78±8.97?Huangjiao granule1.53±0.58?#19.17±3.38?#41.06±5.46?#

*P<0.05vssham operation group;#P<0.05vsmodel group.

2 黃角顆粒對大鼠腦梗死的影響

TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織未出現(xiàn)白色梗死灶；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的白色梗死灶，腦梗死體積百分比為(31.38±3.53)%；黃角顆粒組大鼠腦組織出現(xiàn)輕微梗死，腦梗死百分比為(19.17±3.38)%。與假手術(shù)組相比，腦梗死百分比明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，黃角顆粒組大鼠腦梗死百分比明顯減少，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

Figure 1. TTC staining of rat brain tissue in each group.

圖1各組大鼠腦組織TTC染色圖

3 黃角顆粒對大鼠腦組織病理結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織細胞的固縮核和神經(jīng)元染色均顯著增加，神經(jīng)元細胞損傷程度加重；與模型組相比，黃角顆粒組大鼠細胞的固縮核和神經(jīng)元染色均顯著降低，其神經(jīng)元細胞損傷程度減輕,見圖2。

Figure 2. HE staining of rat brain tissue in each group (×200).

圖2各組大鼠腦組織HE染色圖

4 黃角顆粒對大鼠腦細胞凋亡的影響

TUNEL檢測結(jié)果示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織可見大量凋亡細胞(P<0.05)；與模型組相比，黃角顆粒組大鼠腦組織凋亡細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，見表1、圖3。

Figure 3. TUNEL staining of rat brain tissue in each group (×400).

圖3各組大鼠腦組織TUNEL染色

5 黃角顆粒對大鼠腦組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠腦組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平較低，而模型組大鼠腦組織中可檢測到大量p-JAK2和p-STAT3蛋白(P<0.05)；與模型組相比，黃角顆粒組大鼠腦組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平顯著降低(P<0.05),見圖4。

Figure 4. The protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in the rat brain tissues in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham operation group;#P<0.05vsmodel group.

圖4各組大鼠腦組織p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達

討 論

腦缺血再灌注損傷是一個極其復(fù)雜的病理生理過程，其發(fā)病機制涉及到細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸的釋放增加、能量障礙、自由基的產(chǎn)生、細胞自噬以及氧化應(yīng)激等[10],是大多數(shù)缺血性腦血管病的主要病理生理機制。目前，缺血性腦血管病的發(fā)病率較高，且其致殘率和致死率均較高，嚴重危害人類的身心健康，因此，尋找有效的藥物減輕腦缺血再灌注損傷顯得尤為重要。本研究采用線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注模型，探討黃角顆粒預(yù)處理對IRI的影響及其相關(guān)機制，結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷模型大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損狀態(tài)，其腦組織出現(xiàn)腦梗死病灶以及神經(jīng)元損傷等病理狀態(tài)，腦組織細胞凋亡增加，腦組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平增加；提前給予黃角顆粒治療的腦缺血再灌注損傷大鼠的病理損傷明顯減輕，腦組織細胞凋亡顯著減少，腦組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平顯著降低，提示黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷具有顯著的抑制作用。

JAK/STAT信號通路與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，其可通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄模式的變化，進一步調(diào)控細胞存活或死亡而影響腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展[11-12]。JAK/STAT信號通路由Janus酪氨酸激酶家族JAK、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白STAT組成。JAK2蛋白主要在大鼠大腦神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)和少數(shù)膠質(zhì)細胞內(nèi)表達；STAT3蛋白則廣泛分布在大鼠整個大腦神經(jīng)系統(tǒng)[13]。JAKs通常與細胞因子、生長因子等細胞膜上的受體結(jié)合并磷酸化而激活，磷酸化的JAKs催化STATs發(fā)生自身磷酸化后，轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，與特定DNA序列相結(jié)合而激活目的基因表達[14]。生理狀態(tài)下，JAKs和STATs的磷酸化在大鼠腦中正常表達，而發(fā)生腦缺血再灌注損傷時其表達量則顯著增加[15]。劉榮等[16]的研究表明局灶性腦缺血大鼠腦組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平高于假手術(shù)組，即腦缺血導(dǎo)致JAK2/STAT3信號通路異常激活，可能為腦缺血再灌注損傷加重的機制之一，而電針治療腦缺血可下調(diào)p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平，阻斷JAK2/STAT3信號通路的異?；罨?。JAK2/STAT3信號通路具有快速激活的特征，當細胞因子、生長因子等配體與細胞膜上的相應(yīng)受體相結(jié)合形成JAKs結(jié)合位點，一方面，JAKs與相應(yīng)位點相結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化而激活JAKs，另一方面，活化后的JAKs與STATs蛋白相結(jié)合而激活目的基因表達[17]。因此，本研究檢測磷酸化的JAK2和STAT3的表達水平，結(jié)果表明模型組大鼠腦組織表現(xiàn)出高水平的p-JAK2和p-STAT3，而假手術(shù)組僅見少量蛋白，可推測JAK2/STAT3信號通路的異常激活在腦缺血再灌注損傷中具有重要作用。在提前給予黃角顆粒干預(yù)后，黃角顆粒組大鼠腦組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平下調(diào)，即表明通過抑制JAK2/STAT3信號通路的異常激活可能是黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠發(fā)揮保護作用的機制之一。

綜上所述，黃角顆?？娠@著改善腦缺血再灌注大鼠的病理損傷，減少腦組織細胞凋亡，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路的異常激活相關(guān)，但其是否還通過其它信號通路聯(lián)合發(fā)揮作用尚需進一步更深入的研究。