孕婦O型血中抗A、抗B效價檢測的方法學研究

朱文剛

(阜陽市人民醫(yī)院南區(qū) 輸血科，安徽 阜陽236011)

人類血型至今已知有36種，ABO血型系統(tǒng)在臨床輸血及致新生兒溶血病實驗中意義最為重要，其中孕婦為O型，不規(guī)則抗體陰性，配偶為非O型常常需要檢測抗A、B效價，因為孕婦體內(nèi)抗A、B IgG型抗體效價過高(大于256)會通過胎盤屏障與胎兒(非O型)紅細胞結合、致敏而發(fā)生新生兒溶血病[1，2]。因此，常通過檢測孕婦血漿中抗A、B效價來評估新生兒溶血病發(fā)生的可能性[3]。目前用2-Me處理標本常達不到實驗要求，為了更好地檢測抗體效價的真實水平和提高檢出率，我們利用IgM冷凝集的特性，在4℃用標準A、B紅細胞吸附O型孕婦血漿中的IgM抗體與2-Me處理樣本進行比較，并統(tǒng)計分析兩者的檢出率。

1 材料與方法

1.1研究對象收集2014年12月-2017年5月門診孕檢孕婦O型全血樣本842份，中位年齡 28 歲(17-45)歲。

1.2主要試劑與儀器微柱凝膠抗人球蛋白卡、微柱凝膠蛋白卡專用離心機(長春博訊生物技術有限公司)，標準A、B紅細胞、抗篩譜細胞、2-Me(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司)，離心機(武漢貝索生物有限公司)，S.HH.W型數(shù)字顯示式恒溫水溫箱(上海東榮豐科學儀器有限公司)。

1.3用微柱凝膠抗人球蛋白卡進行檢測操作步驟

1.3.12-Me處理血漿 將2-Me與被檢測血漿各400 μl按1∶1比例加入標記的試管中，在37℃下溫育30 min處理，用生理鹽水按照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048倍比稀釋，將稀釋好的各管分別按順序加入對應標記的抗人球蛋白卡中，最后將A、B紅細胞懸液(0.8-1.0)%加入對應的抗人球蛋白卡中，溫育15 min，離心5 min，觀察、記錄結果。

1.3.24℃紅細胞吸附處理血漿 分別取標本血漿400 μl置于標記“A”“B”2支試管中，并置于4℃溫箱中1 h，將(3.0-5.0)%A、B紅細胞懸液，并置于4℃溫箱中1 h，將紅細胞懸液各400 μl分別加入相應的加入血清的標記試管中，3 000轉/min，離心15 s，取上清液400微升加入第二管，觀察凝集強度。依次處理到第十管(1∶2048)，其間每管觀察結果，直至無肉眼可見的凝集。最后用抗人球蛋白卡檢測，觀察結果。

1.3.3分別取標本血漿400 μl置于標記“A”“B”2支試管中，并置于37℃溫箱中1 h，將(3.0-5.0)%A、B紅細胞懸液，并置于37℃溫箱中1 h，將標準紅細胞懸液各400 μl分別加入相應的加入血清的標記試管中，3000轉/min，離心15 s，取上清液400 μl加入第二管，觀察凝集強度。依次處理到第十管(1∶2048)，其間每管觀察結果，直至無肉眼可見的凝集。最后用抗人球蛋白卡檢測，觀察結果。

1.3.4結果判定 以一個加號(+)作為判斷終點，以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為最終數(shù)值。

1.4統(tǒng)計方法采用Graphpad Prism5統(tǒng)計軟件，率的檢驗用χ2檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1孕檢門診842例樣本中經(jīng)2-Me處理符合檢測標準的595例，用4℃紅細胞吸附方法處理后亦可檢出相應的抗A，B效價，247例不符合實驗要求的標本用4℃紅細胞吸附方法處理，效價檢測結果全部高于參考值(256)，所以這類標本IgG抗體效價高于參考值(>256)。

2.2本研究比較了2-Me破壞IgM與4℃ A，B紅細胞吸附IgM在不同效價組別的檢出率，效價在≥32以上兩種方法的檢出率存在明顯差異(表1)。

2.3本研究2-Me處理樣本和4℃吸附處理樣本對比 若以2-Me處理標本組的256做為參考值，4℃吸附處理標本組可以128做為參考值；或仍以2-Me處理標本組的256做為參考值，用4℃吸附處理標本，相應結果增加相應效價組別稀釋梯度(表2)。

3 討論

近年來，隨著人們對健康及優(yōu)生優(yōu)育的意識不斷加強，產(chǎn)科門診孕婦數(shù)量不斷增加。對于孕婦血型為O(不規(guī)則抗體陰性)配偶非O型，產(chǎn)科門診要求檢測抗A、B效價以評估孕婦體內(nèi)抗體IgG水平，從而間接預測ABO血型系統(tǒng)致新生兒溶血病的可能性[4，5]，但是往往由于IgM的存在干擾檢測結果，不能反映孕婦血清中抗A、B效價[6]，在臨床中經(jīng)常需要對于效價過高或效價逐漸增高的孕婦在孕期內(nèi)進行干預，從而預防或減少新生兒溶血病的發(fā)生[7]。

表1 不同方法處理樣本在不同效價組別的檢出率比較

表2 4℃吸附處理樣本較2-Me增加的稀釋梯度數(shù)

目前檢測IgG抗A、抗B效價時，通常用2-Me滅活IgM抗體，在實際實驗過程中，2-Me滅活IgM抗體時一部分標本無法達到實驗要求且2-Me對人體有危害、污染環(huán)境[8，9]。近期研究發(fā)現(xiàn)在4℃或37℃條件下，用標準A(B)紅細胞(3.0%-5.0%)吸附血漿中的IgM可達到實驗目的，但在37℃紅細胞吸附過程中，由于溫抗體效應，不僅吸收了IgM抗體，也吸附了IgG抗體，所以37℃處理標本對IgG類型抗體影響較大[10]。我們結果顯示若以2-Me處理標本的效價256做為參考值，通過對比4℃用標準紅細胞處理標本參考值可為128；或仍以256做為參考值，相應的組別增加相應的稀釋梯度。

我們對2-Me處理后達不到實驗要求的樣本用4℃紅細胞懸液吸附處理后IgG效價仍高于參考值(256)，說明這一類標本中不僅IgM含量高，IgG抗體含量也高，因此2-Me處理后樣本IgG效價檢測結果容易出現(xiàn)假陰性，而在4℃通過A、B紅細胞(3.0%-5.0%)吸附可明顯提高檢測陽性率，可更好地反映孕婦血清中IgG效價的真實水平，以減少新生兒溶血癥的發(fā)生。