輸尿管不全梗阻大鼠輸尿管平滑肌損傷及肌球蛋白表達(dá)變化的臨床意義

安文亞，趙澤駒，羅逸航，辜浩，吳宇波

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

輸尿管不全梗阻臨床較為多見，多與結(jié)石有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，輸尿管不全梗阻時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)機(jī)體的損害越重，且輸尿管損害先于腎損害[1]。2016年11月～2017年9月,本研究觀察了輸尿管不全梗阻大鼠梗阻不同時(shí)間輸尿管形態(tài)結(jié)構(gòu)及平滑肌細(xì)胞肌球蛋白表達(dá)變化，旨在為臨床判斷輸尿管不全梗阻患者的輸尿管功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：健康10～12周齡SD大鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK-(渝)2012-0005。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，雌雄分開，普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫18～22 ℃，相對(duì)濕度45%～65%。試劑與儀器：肌球蛋白兔抗鼠一抗(SA1022)、抗體稀釋液(AR10161)、即用型正常山羊血清(AR0009)，武漢博士德生物工程有限公司；肌球蛋白重鏈mRAN，南京金斯瑞生物科技有限公司。免疫組化檢測(cè)試劑盒(GK500705)，上海基因科技股份有限公司；TransZol Up、逆轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司。CKX31普通光學(xué)倒置顯微鏡，日本Olympus公司；MyiQ2定量PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 輸尿管不全梗阻模型制作 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3周，隨機(jī)分為對(duì)照組30只、假手術(shù)組45只和模型組45只。模型組參照腰大肌隧道包埋法[2,3]制作輸尿管不全梗阻模型：10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，下腹正中切口，腹腔探查，于膀胱附近分離、游離右側(cè)輸尿管下段約2.0 cm，于右側(cè)輸尿管后方腰大肌處鈍性分離出一條長(zhǎng)約2.0 cm、深約0.5 cm的裂隙，將游離的輸尿管下段置于裂隙底部；腹腔放少量青霉素，1號(hào)絲線間斷縫合2針關(guān)閉裂隙，縫合切口。假手術(shù)組分離裂隙后不放置游離的輸尿管，其余操作同模型組。對(duì)照組不制作輸尿管不全梗阻模型，正常飼養(yǎng)。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 造模1、2、3周隨機(jī)選擇對(duì)照組10只、假手術(shù)組及模型組各15只處死。對(duì)照組及假手術(shù)組探查腹腔，分離并切取右側(cè)腎及輸尿管；模型組找到右側(cè)輸尿管下段包埋處線結(jié)，分離顯露輸尿管、腎臟，貼膀胱壁剪斷輸尿管，擠壓腎臟見尿液從近側(cè)斷端流出，切除右側(cè)腎臟及輸尿管。觀察三組以下指標(biāo)。①輸尿管、腎臟形態(tài)及右側(cè)輸尿管直徑：肉眼觀察輸尿管及腎臟形態(tài)，測(cè)量右側(cè)輸尿管三個(gè)橫斷面直徑(游標(biāo)卡尺0.05 mm)，結(jié)果取平均值。②輸尿管平滑肌細(xì)胞形態(tài)：取輸尿管用4%多聚甲醛固定、包埋、切片，采用HE染色觀察不同時(shí)段輸尿管平滑肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。③輸尿管平滑肌肌球蛋白表達(dá)：采用免疫組化SP法檢測(cè)。取三組輸尿管平滑肌組織切片，參照試劑盒說明書進(jìn)行輸尿管平滑肌肌球蛋白表達(dá)檢測(cè)。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。以平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。采用Leica Qwin和Image-proplus6.0圖像處理系統(tǒng)測(cè)量各組平均光密度(IOD)。④輸尿管平滑肌肌球蛋白重鏈mRNA表達(dá)：采用qRT-PCR法檢測(cè)。采用TRIzol法提取三組各時(shí)間點(diǎn)輸尿管平滑肌肌球蛋白總RNA，以RNA為模板，按照EasyScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，用TransStart試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR?；驍U(kuò)增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。引物序列：肌球蛋白重鏈上游引物5′-GGCAAGAAGCAGATCCAGA-3′，下游引物5′-CTTCAACATTGCGCTTCTGT-3′；β-actin上游引物5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游引物5′-GGGGTGTTGAAGGTCTVAAA-3′。PCR反應(yīng)體系：2×TransStart Tip Green qPCR Supermix 5.0 μL，10 mol/L上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足總體積至10 μL；每孔加入10 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。PCR反應(yīng)條件：94.0 ℃變性30 s，94.0 ℃退火5 s，60.0 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組輸尿管及腎臟形態(tài)比較 造模1、2、3周對(duì)照組與假手術(shù)組腎及輸尿管形態(tài)比較無明顯差異。與對(duì)照組與假手術(shù)組相比，模型組梗阻1周時(shí)近端輸尿管稍增粗；腎臟體積略有增大、張力稍高；2周時(shí)輸尿管增粗明顯，壁厚；腎臟體積增大、包膜張力高、皮質(zhì)變薄、腎盂擴(kuò)張；3周時(shí)梗阻近端輸尿管顯著增粗，管壁明顯變??；腎臟體積增大、外形不規(guī)則，腎實(shí)質(zhì)菲薄，腎盂、腎盞變形、擴(kuò)大。模型組造模1、2、3周右側(cè)輸尿管直徑逐漸增大，且均較對(duì)照組、假手術(shù)組增加(P均<0.01)；對(duì)照組與假手術(shù)組輸尿管直徑比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>均0.05)。見表1。

表1 三組右側(cè)輸尿管直徑比較

注：與對(duì)照組及假手術(shù)組比較，△P<0.01。

2.2 三組輸尿管平滑肌組織細(xì)胞形態(tài)比較 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組、假手術(shù)組輸尿管平滑肌細(xì)胞各時(shí)段變化無明顯差異，細(xì)胞層次清晰、排列整齊、胞質(zhì)及胞核無明顯異常。模型組1、2周梗阻近端輸尿管平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)代償肥大增生，胞核增大，細(xì)胞排列部分紊亂，梗阻時(shí)間越長(zhǎng)，上述表現(xiàn)越明顯；但模型組3周時(shí)出現(xiàn)梗阻近端輸尿管平滑肌細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核萎縮，部分平滑肌細(xì)胞被增生的纖維結(jié)蹄組織替代，與模型組1、2周形成明顯差別。

2.3 三組輸尿管平滑肌肌球蛋白表達(dá)比較 造模1、2周，模型組輸尿管平滑肌肌球蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組和假手術(shù)組，術(shù)后3周均低于對(duì)照組和假手術(shù)組，組間比較P均<0.01；造模1、2、3周,模型組肌球蛋白表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均<0.01；對(duì)照組與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 三組輸尿管平滑肌肌球蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組及假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組造模1周比較，△P<0.01;與模型組造模2周比較，#P<0.01。

2.4 三組輸尿管平滑肌肌球蛋白重鏈mRNA表達(dá)比較 造模1、2周,模型組輸尿管平滑肌肌球蛋白重鏈mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組和假手術(shù)組，造模3周均低于對(duì)照組和假手術(shù)組，組間比較P均<0.01；造模1、2、3周，模型組肌球蛋白重鏈mRNA相對(duì)表達(dá)量各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均<0.01；對(duì)照組與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 三組輸尿管平滑肌肌球蛋白重鏈mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組及假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組造模1周比較，△P<0.01;與模型組造模2周比較，#P<0.01。

3 討論

輸尿管是肌性、管狀、空腔器官，依賴平滑肌節(jié)律性收縮協(xié)助排尿。發(fā)生梗阻后尿液滯留，梗阻近端壓力升高，輸尿管、腎盂平滑肌收縮力反射性增加，以排出更多尿液緩解壓力，保護(hù)腎臟泌尿功能[4]。輸尿管完全梗阻時(shí)，隨時(shí)間延長(zhǎng)尿液潴留增加，近端積水及壓力快速升高，腎盂壓>10 mmHg時(shí)出現(xiàn)腎實(shí)質(zhì)返流，腎血流分布改變，髓質(zhì)流量增加，泌尿功能逐漸下降甚至停止，此時(shí)輸尿管、腎盂維持高壓，功能停止，不可逆性損害持續(xù)，出現(xiàn)萎縮性改變[5,6]。輸尿管不全梗阻時(shí)，因始終有部分尿液排出，梗阻近端壓力有一定程度緩解，輸尿管、腎盂平滑肌收縮、擴(kuò)張以期排出更多尿液，呈現(xiàn)由代償?shù)绞Т鷥數(shù)霓D(zhuǎn)化過程。隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，輸尿管擴(kuò)張、積水逐漸增加，波及腎臟，導(dǎo)致腎積水、體積增大、實(shí)質(zhì)萎縮，最終使輸尿管過度擴(kuò)張?jiān)龃诸愃朴凇澳c管”，巨大腎積水形成，輸尿管管壁及腎實(shí)質(zhì)均菲薄，腎單位耗竭。梗阻解除后輸尿管及腎功能能否恢復(fù)與不全梗阻時(shí)間有關(guān)[7]。部分患者腎功能恢復(fù)，但近端輸尿管過度擴(kuò)張、積水，腎臟代償性積水增大、實(shí)質(zhì)萎縮，輸尿管仍擴(kuò)張、積水、收縮乏力，極易因再發(fā)小結(jié)石、尿鹽結(jié)晶、脫落壞死組織或感染性膿苔等形成再梗阻，甚至誘發(fā)腎功能衰竭[8]。

在輸尿管不全梗阻過程中，輸尿管病理損害先于腎臟損害出現(xiàn)，且輸尿管平滑肌最先受累[9]。梗阻早期輸尿管即可出現(xiàn)肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)破壞、鈣超載、線粒體和肌球蛋白等超微結(jié)構(gòu)異常[10～12]；平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡失調(diào)，導(dǎo)致鈣離子分布紊亂，出現(xiàn)鈣離子超載，通過影響線粒體膜通透性及鈣調(diào)蛋白活性導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞受損及凋亡[13]。平滑肌肌球蛋白由兩條輕鏈和兩條重鏈構(gòu)成六聚體，兩條重鏈通過C端的α-螺旋結(jié)構(gòu)相互作用形成二聚體，構(gòu)成肌球蛋白的主體[14]。肌球蛋白可分為頭部、頸部和尾部三個(gè)部分。頭部有與肌動(dòng)蛋白結(jié)合部位及與ATP結(jié)合部位，與其長(zhǎng)軸成角，因此也稱為橫橋；頸部是α-螺旋結(jié)構(gòu)，可與兩個(gè)輕鏈相結(jié)合，起著調(diào)整頭部活動(dòng)性的作用[15]；頸部之后是α-螺旋的尾部，末端是非螺旋化的較短的結(jié)構(gòu)域。每個(gè)肌球蛋白分子含有兩個(gè)完全相同的頭部，都具有Ca2+-ATP酶活性，其活性直接影響肌纖維的收縮力量及速度。肌球蛋白的變化包括信使mRNA相對(duì)表達(dá)量、肌球蛋白表達(dá)量、肌球蛋白構(gòu)象以及肌球蛋白活性改變等形式[16]。肌球蛋白對(duì)輸尿管病理損害最為敏感，輸尿管梗阻期間肌球蛋白的變化規(guī)律可反映不同時(shí)段輸尿管平滑肌功能狀態(tài)，對(duì)輸尿管及腎臟損傷有預(yù)警作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，近端輸尿管逐漸擴(kuò)張，造模2、3周時(shí)腎盂擴(kuò)張積水、腎臟體積增大，提示輸尿管不全梗阻2、3周時(shí)已出現(xiàn)腎臟損害。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，梗阻2周時(shí)輸尿管平滑肌肌層增厚，細(xì)胞代償性增生肥大，細(xì)胞核變大，呈長(zhǎng)梭型；但梗阻3周時(shí)管壁平滑肌纖維卻明顯減少，肌層變薄、細(xì)胞萎縮、核小而圓、細(xì)胞排列紊亂、纖維增生明顯，與梗阻2周時(shí)比較差異顯著。梗阻1、2周時(shí)肌球蛋白表達(dá)量逐漸增加，但3周時(shí)則顯著降低，甚至低于對(duì)照組與假手術(shù)組；肌球蛋白重鏈mRNA相對(duì)表達(dá)量也呈類似變化。說明不全梗阻過程中，平滑肌細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)變化與形態(tài)結(jié)構(gòu)改變相適應(yīng)。上述變化提示梗阻3周時(shí)平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)了不可逆性損傷[17]。輸尿管梗阻后平滑肌細(xì)胞損害或凋亡增加使肌球蛋白重鏈mRNA表達(dá)量發(fā)生變化，進(jìn)而影響肌球蛋白表達(dá)，最終導(dǎo)致其功能改變。白志明等[18]研究證實(shí)，肌球蛋白表達(dá)與其功能狀態(tài)密切相關(guān)。本研究模型組梗阻2～3周期間肌球蛋白表達(dá)變化說明此段時(shí)間輸尿管功能是代償?shù)绞Т鷥數(shù)霓D(zhuǎn)化，梗阻2周內(nèi)解除梗阻可阻止輸尿管繼續(xù)損害。

綜上所述，輸尿管不全梗阻時(shí)間越長(zhǎng)、平滑肌損傷越重；梗阻超過2周將出現(xiàn)輸尿管功能不可逆性損傷。