樹鼩大腸內(nèi)容物細菌的群落多樣性分析

郭玉倩，角建林，袁 鑫，吳 超，王利梅，鄭 紅*

(1.昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，昆明 650500； 2.昆明醫(yī)科大學技術(shù)轉(zhuǎn)移中心，昆明 650031； 3.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，昆明 650032)

動物大腸中棲息著種類繁多、數(shù)量巨大的細菌，與宿主形成了穩(wěn)定的互利共生關(guān)系，在腸道中長期穩(wěn)定存在。這些菌群影響宿主的營養(yǎng)代謝、生物拮抗、免疫刺激及生長發(fā)育等功能。因此，大腸微生態(tài)的穩(wěn)定，對樹鼩的健康有重要作用。微生物培養(yǎng)技術(shù)僅能研究體外可生長的微生物[1]，這部分細菌僅占胃腸道微生物的1%左右[2]。那些能在培養(yǎng)基上生長的微生物，其重要性會被過高估，且克隆/測序技術(shù)費時費力分辨率低[3]。高通量測序技術(shù)是一種研究微生物生態(tài)學的全新技術(shù)手段，能全面地反應樣品微生物的結(jié)構(gòu)與組成[4]，具有準確性高、檢測范圍廣、快速、結(jié)果可靠等優(yōu)點，普遍應用于細菌多樣性分析[5]。

樹鼩(Tupaiabelangeri，tree shrew)是生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳綱攀鼩類的小型動物，在我國云南、貴州、廣西、廣東等地廣泛分布。樹鼩具有體型小，繁殖能力強，易馴養(yǎng)，經(jīng)濟易得等優(yōu)點。樹鼩的新陳代謝與解剖結(jié)構(gòu)比嚙齒類更接近于非人靈長類動物，常用于替代或減少一些非人靈長類動物的使用。由于其與人類在細胞與分子層面的相似性，在作為人類疾病動物模型方面具有很大的前景。樹鼩已在腫瘤學、內(nèi)分泌學、神經(jīng)生物學、生殖生物學、免疫學及感染性疾病等方面有廣泛和深入的應用，是價值極高的新型實驗動物[6]。

目前，有關(guān)樹鼩腸道細菌的報道較少[7-10]。這些研究主要采用的是傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)，以及以克隆/測序為主要手段的分子生物學技術(shù)。已有的報道缺乏有關(guān)樹鼩腸道細菌的高通量測序研究。因此，本試驗旨在應用高通量測序技術(shù)研究樹鼩大腸細菌結(jié)構(gòu)與組成，為進一步開發(fā)利用這一新型實驗動物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

3只雄性10月齡樹鼩，體重130～150 g，編號A、B、C，由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供[SCXK (滇) K2013-0002]。飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學普通級實驗室[SYXK (滇) K2015-0002]，樹鼩單籠飼養(yǎng)，自由飲水，每日定時飼喂全價顆粒飼料2次(8:00和14:00)，動物飼養(yǎng)溫度22℃～25℃，濕度40%～60%，每日明暗交替照明12 h。實驗程序符合昆明醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會要求(KMMU2017016)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

動物全價顆粒飼料配方為：玉米40%、大麥17%、大米10%、豆粕17%、魚粉8%、苜蓿粉2.0%、蔗糖1.0%、果糖0.5%、牛油1.5%、豬油1.0%、雞蛋粉1.2%以及氨基酸、維生素和微量元素等添加劑0.8%。DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)。熒光定量系統(tǒng)QuantiFluorTM-ST(Promega，U.S.)；PCR儀(ABI GeneAmp? 9700型)。采用Hiseq2500測序儀(Illumina公司)的PE150測序策略完成測序。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物處理

樹鼩穩(wěn)定飼喂60 d，在61 d禁食8 h，心臟采血處死動物。取大腸，用0.5 mL生理鹽水沖洗大腸內(nèi)容物，收集沖洗液至離心管，迅速投入液氮中保存，樣品立即帶回實驗室轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，備用。

1.3.2 基因組DNA提取

使用DNA提取試劑盒，按照說明書進行細菌基因組抽提。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測抽提的樹鼩大腸內(nèi)容物細菌基因組DNA。

1.3.3 PCR擴增

測序是區(qū)域341F～806R。使用341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’和806R：5’-GGACTA CNNGGGTATCTAAT-3’細菌特異性引物進行細菌16SrDNA基因部分序列的PCR擴增。

1.3.4 熒光定量

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序要求，進行相應比例的混合。

1.3.5 Illumina PE250文庫構(gòu)建

連接“Y”字形接頭。使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集。經(jīng)氫氧化鈉變形，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

1.3.6 Illumina PE250測序

DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上。另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋(bridge)”。PCR擴增，產(chǎn)生DNA簇。DNA擴增子線性化成為單鏈。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個堿基。用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類。將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3’端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，得到模板DNA片段的序列。

1.3.7 生物信息學分析

Illumina PE250測序得到的PE reads，首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接[11]，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾。優(yōu)化樣本序列后，將序列按97%相似性進行運算分類單位(operational taxonomic unit，OTU)聚類[12]，并進行α多樣性指數(shù)分析，計算Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和覆蓋(Coverage)指數(shù)。每個樣本都做了稀釋性曲線和Shannon指數(shù)曲線。用UniFrac對β多樣性進行評估，利用基于UniFrac的主坐標分析(principal coordinate analysis，PCoA)，將UniFrac距離映射到一組正交軸上。采用RDP classifier貝葉斯算法，對OTU代表序列進行分類學分析[13]。統(tǒng)計在門、綱、目、科、屬、種水平上的物種組成和豐度。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 樣本序列分析和多樣性分析

將本實驗得到的樣本序列進行優(yōu)化(表1)，共獲得160 157條有效序列，平均每個樣本有(53 386±2807)條序列?；谛蛄?7%的相似性進行OTU聚類，共得到437個OTU。樣本稀釋性曲線(圖1)顯示，每個樣本的曲線都趨于平緩，說明本研究的測序量能夠覆蓋各樣本的大多數(shù)微生物。

表1 樣本序列統(tǒng)計表Table 1 Statistics of sample sequences

圖1 稀釋性曲線Figure 1 Rarefaction curves

基于OTU聚類分析結(jié)果，對OTU進行α多樣性分析(表2)，樹鼩大腸細菌的Chao指數(shù)是181，Shannon指數(shù)是2.5，Simpson指數(shù)為0.21。覆蓋指數(shù)為0.999，即包含了樹鼩大腸內(nèi)容物中99.9%的細菌多樣性狀況，反映了測序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實情況。Shannon指數(shù)曲線(圖2)顯示，樣本A的微生物群比B和C更多樣化。

未加權(quán)PCoA(圖3B)顯示，第一個主坐標(PC1)捕獲了43.42%的變異，第二個主坐標(PC2)捕獲了16.84%的變異，A與B、C分離開，而B、C聚合在一起；加權(quán)PCoA(圖3A)顯示，第一個主坐標(PC1)捕獲了52.69%的變異，第二個主坐標(PC2)捕獲了29.43%的變異。加權(quán)以后三個樣本仍沒有聚合起來，樣本間存在一定差異。

圖2 菌群多樣性分析Figure 2 Flora diversity analysis

豐度指數(shù)Chao index菌群多樣性指數(shù) Flora diversity indicesShannon指數(shù)Shannon indexSimpson指數(shù)Simpson index覆蓋指數(shù)Coverage indexx±s181±532.5±0.580.21±0.060.999±0.0002

注：A：加權(quán)；B：未加權(quán)。圖3 β多樣性的主坐標分析Note. A: Weighted; B: Unweighted.Figure 3 β-diversity patterns were explored using principal coordinate analysis

2.2 不同分類水平上的物種組成分析

本研究發(fā)現(xiàn)，樹鼩大腸中的細菌有9個門、19個綱、37個目、68個科、137個屬和194個種。

在鑒定出的9個門中，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)的豐度最高(91.82%)，分別為63.30%和28.52%。其次是放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，豐度分別是5.49%、2.56%。以上4個門的豐度和為99.84%。其他5個門，包括梭桿菌門(Fusobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、酸桿菌門(Acidobacteria)、Saccharibacteria門，豐度之和僅為0.14%(圖4)。

圖4 門水平上菌群組成Figure 4 Composition of microbial community at the phylum level

在檢出的19個綱中，豐度最高的是芽孢桿菌綱(Bacilli)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，分別是51.46%、28.02%。其次是梭菌綱(Clostridia)：6.98%，丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)：4.53%，放線菌綱(Actinobacteria)：3.58%，擬桿菌綱(Bacteroidia)：2.46%和Coriobacteriia綱：1.91%。以上7個綱的豐度和為98.94%。其他12個綱的豐度和僅為1.0%，包括嚴格厭氧菌綱(Negativicutes)、ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、梭桿菌綱(Fusobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、Chloroplast綱、Saccharibacteria_norank綱、酸桿菌綱(Acidimicrobiia)、脫鐵桿菌綱(Deferribacteres)和全噬菌綱(Holophagae)。

在鑒定出的37個目中，乳桿菌目(Lactobacillales)和腸桿菌目(Enterobacteriales)的豐度最高，為45.33%和27.51%。其次是梭菌目(Clostridiales)、芽孢桿菌目(Bacillales)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)、雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)、擬桿菌目(Bacteroidales)和Coriobacteriales目，6個目的豐度依此降低，分別為6.98%、6.13%、4.53%、3.35%、1.91%、1.81%(圖5)。其他29個目，如Selenomonadales目、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、彎曲菌目(Campylobacterales)、脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)、棒桿菌目(Corynebacteriales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、梭桿菌目(Fusobacteriales)和黃桿菌目(Flavobacteriales)等，豐度之和僅為1.81%。

68個科中，11個科的豐度和超過90%。其中乳桿菌科(Lactobacillaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的豐度和超過60%，分別為35.30%和27.51%。豐度在1%～10%之間的有9個科，由高到低依次為鏈球菌科(Streptococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和紅蝽桿菌科(Coriobacteriaceae)。這9個科的豐度分別是6.72%、4.88%、4.52%、3.35%、2.95%、2.66%、2.24%、2.03%、1.91%。其他57個科的豐度均低于1%，包括瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、韋榮氏球菌科(Veillonellaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、揉桿菌科(Carnobacteriaceae)、螺桿菌科(Helicobacteraceae)和脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)等。這56個科的豐度和僅為4.52%。

137個屬中，乳桿菌屬(Lactobacillus)和埃希氏菌(Escherichia-Shigella)屬占主導，豐度和為62.79%(35.30%、27.49%)。其次是鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、Erysipelatoclostridium屬、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、Lachnoclostridium屬、芽孢桿屬(Bacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、普雷沃菌屬(Prevotella9)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和柯林斯氏菌屬(Collinsella)。這11個屬的豐度和為28.83%，各屬的豐度依此分別為4.62%、4.19%、3.35%、2.95%、2.65%、2.31%、2.23%、2.11%、2.03%、1.3%和1.09%(圖6)。其余的126個屬的豐度極低，總占比僅8.37%。

圖6 屬水平上群落組成Figure 6 Composition of microbial community at the genus level

194個種中，可培養(yǎng)細菌的豐度和為37.10%，未分類細菌為27.69%，不可培養(yǎng)細菌35.21%(圖7)?？膳囵B(yǎng)細菌中，唾液鏈球菌(salivarius)的豐度最高(26.66%)。豐度在0.38%～2.91%之間的有5個種，從高到低依次為treptococcusporcorum種(2.91%)、Enterococcusfaecali種(1.57%)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，1.56%)、Slackiapiriformis種(0.42%)和Bifidobacteriumkashiwanohense種(0.38%)。

圖7 種水平上細菌分類Figure 7 Bacterial classification at the species level

豐度最高的20個種，歸類為10個科、7個綱。即雙歧桿菌科、芽孢桿菌科、乳桿菌科、葡萄球菌科、鏈球菌科、普雷沃氏菌科、毛螺菌科、紅蝽桿菌科、丹毒絲菌科和腸桿菌科。這20個種，隸屬于芽孢菌綱、梭菌綱、放線菌綱、丹毒絲菌綱、Bacteroidia綱、Coriobacteriia綱和γ-變形菌綱7個綱。在豐度最高的20個種中，8種細菌(40%)未分類，為以往未被發(fā)現(xiàn)的新種。7種(35%)不能培養(yǎng)，能培養(yǎng)的已知細菌(25%)僅為5種(表3)。

表3 種水平上豐度較高的20個種及其在綱和科水平上的歸類Table 3 The 20 most abundant species and their classification at class and family levels

2.3 不同個體之間的物種組成比較

在門層面，三個樣本共享的5個門分別是厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門。藍藻菌門、脫鐵桿菌門、Saccharibacteria門和酸桿菌門為A特有，這4個門的豐度和僅占A樣本總腸道微生物的0.11%。B樣本中的厚壁菌門和變形菌門與A、C樣本相比有較大差異，厚壁菌門在樣本A、B、C中的豐度比是3.8∶1∶3.6，變形菌門在樣本A、B、C中的豐度比是1∶9.1∶0.92。而放線菌門在三個樣本中的豐度沒有太大變化，豐度比為1∶1.39∶1.12。

檢測到的137個屬中，65個屬為樣本A獨有，3個屬僅見于樣本B，C為4個屬。A獨有的65個屬的豐度和是11.56%，其中只有兩個屬的豐度和大于1%，分別是乳球菌屬(6.32%)和Subdoligranulum屬(1.19%)。B組特有的屬是魏斯氏菌屬、Senegalimassilia屬和Faecalitalea屬，豐度均低于0.1%。樣本C獨有的屬分別是鏈霉菌屬(0.01%)、Eggerthella屬(0.007%)、Alloprevotella屬(0.003%)和黃桿菌屬(0.003%)。乳桿菌屬的豐度較高，但三個樣本中的差異也較大，C為75.26%，B中20.15%，A為10.50%。

3 討論

目前，有關(guān)樹鼩腸道菌群的報道較少[7-10]，并且都是基于對菌株進行培養(yǎng)后，進行鑒定的檢測方法。這些研究不能系統(tǒng)且全面地闡述樹鼩腸道細菌多樣性。本實驗通過Illumina PE250高通量測序，研究樹鼩大腸微生物群的物種組成及其豐度。其中，Coverage指數(shù)表示各文庫的覆蓋率，本實驗中覆蓋率為0.999，說明樹鼩大腸細菌99.9%多樣性情況得到反映。每個樣本的稀釋曲線都趨于平緩，表明本實驗的測序量能夠覆蓋各樣本的大多數(shù)微生物。Shannon指數(shù)曲線曲線表示樣本A比B和C的微生物菌群更加多樣化。PCoA分析表明三個樣本間菌群組成存在差異。邢進等[8]采集61只樹鼩回盲部內(nèi)容物分離培養(yǎng)，僅得到6科、15屬、29種樹鼩腸道菌。本研究共鑒定出樹鼩大腸菌的68個科、137個屬、194個種，較全面地反映樹鼩腸道細菌多樣性。

通過OTU分類，本實驗共鑒定出樹鼩腸道菌的9個門。其中，厚壁菌門(63.30%)和變形菌門(28.52%)是優(yōu)勢門；其次是放線菌門和擬桿菌門。劉麗君等[7]對樹鼩糞便細菌進行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)變形菌門的埃希氏菌和變形桿菌以及厚壁菌門的糞腸球菌是樹鼩的主要寄生菌群，與本實驗檢測到的優(yōu)勢門相同，但在種屬層面有較大差異。Hildebrandt等[14]使用高脂肪食物飼喂野生小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠腸道菌群中厚壁菌門和變形菌門的數(shù)量增加，而擬桿菌門含量降低。本研究發(fā)現(xiàn)樹鼩腸道菌中變形菌門豐度較高，推測樹鼩具有較強的脂肪消化功能。

在屬的層次，本研究發(fā)現(xiàn)樹鼩腸道乳桿菌屬和埃希氏菌屬豐度最高。乳桿菌屬和埃希氏菌屬是人和動物腸道的正常菌群[15]。乳桿菌屬重要的益生菌，有改善胃腸道動力、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、抑制抑制腸道炎性反應和抑菌等作用，保護機體腸道健康[16-17]。乳桿菌屬在腸道內(nèi)將多糖降解成短鏈脂肪酸[18]，能合成維生素B1、B2、B6、B12、葉酸、維生素K等多種維生素和蛋白質(zhì)，促進機體的消化吸收。乳桿菌屬還具有抗氧化和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)作用。埃希氏菌屬歸類于腸桿菌科，能幫助機體合成維生素B、K等。一般不致病，偶爾會引起皮膚、黏膜和臟器等自身感染[19]。

唾液鏈球菌在健康人體口腔微生物菌群中占主要地位[20]，是口腔益生菌的重要候選者[21]。唾液鏈球菌能產(chǎn)生細菌素樣抑菌物質(zhì)(BLISs)，具有抑制其他多種微生物的活性，能夠減少病原菌在口腔、呼吸道等部位的定植[22]。Cosseau等[23]研究發(fā)現(xiàn)，唾液鏈球菌K12株能調(diào)節(jié)人體上皮細胞中參與固有免疫防御機制、上皮細胞功能與內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細胞骨架修飾、細胞發(fā)育與轉(zhuǎn)移及信號通路的相關(guān)基因。本實驗發(fā)現(xiàn)唾液鏈球菌是樹鼩可培養(yǎng)腸道菌中豐度最高的物種(26.66%)，其功能及機制有待進一步研究。在豐度最高的20個種中，8種細菌(40%)未分類，為以往未被發(fā)現(xiàn)的新種，需要進一步研究。

本研究使用高通量測序的方法，第一次較全面地檢測了樹鼩腸道菌群。但高通量測序技術(shù)也存在不足，雖然會得到大量數(shù)據(jù)，但后續(xù)數(shù)據(jù)處理費時費力[24]；對于小范圍測序所用的費用相對較高[25]。另外，樣本量較少，需要進一步開展系統(tǒng)研究，建立樹鼩腸道菌群譜，為建立人類腸道微生物樹鼩模型奠定基礎(chǔ)。