建立高尿酸血癥性腎損害小鼠模型的實驗研究

裴憶雪，劉永杰，張 笛，劉德俊，徐凌云

(武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢 430023)

尿酸主要由腎臟排泄，長期高尿酸血癥可導致腎臟病理性損害，可能比蛋白尿所致的腎損害更嚴重，約有三分之一的原發(fā)性高尿酸血癥患者出現(xiàn)腎損害的臨床表現(xiàn)，主要為痛風性腎病、尿酸結(jié)石或尿酸性腎病[1-2]。建立合理穩(wěn)定的高尿酸血癥腎損害動物模型是研究該病的病理機制及篩選治療藥物的關(guān)鍵。已有學者建立了多種高尿酸血癥腎損害動物模型，主要采用增加尿酸前體物質(zhì)、抑制尿酸酶活性及抑制尿酸排泄等方法，多采用大鼠進行造模[3-4]。這些方法有的關(guān)注于高尿酸血癥、模型制作時間偏短、并未出現(xiàn)明顯腎損害，有的是藥物自身導致的腎損害、不符合高尿酸血癥腎損害臨床發(fā)病機制，大多數(shù)造模方法未對動物的一般情況和體重進行觀察。本研究在文獻調(diào)研的基礎(chǔ)上，對多種造模劑單用、合用、不同時間不同劑量建立的小鼠病理模型進行平行比較，除觀察小鼠尿酸和腎功能指標、肝臟黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)和腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)活性之外，還觀察了小鼠一般情況和體重變化，為建立合理的符合臨床特點的高尿酸血癥腎損害動物模型提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性KM小鼠，100只，體重25～30 g，華中科技大學實驗動物中心提供[SCXK (鄂) 2016-0009]，實驗動物飼養(yǎng)于湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司動物實驗中心[SYXK (鄂) 2016-0057]，實驗方案通過實驗動物使用與管理委員會(IACUC)審批，IACUC號：20171125006，本研究過程符合實驗動物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

酵母膏，批號：20160628，北京奧博星生物技術(shù)責任公司；氧嗪酸鉀鹽，批號：P137112，次黃嘌呤，批號：G1725018，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸乙胺丁醇，杭州民生藥業(yè)有限公司，每粒0.25 g，批號：T17A002；腺嘌呤，批號：Y26J8C40561，上海源葉生物科技有限公司；尿酸測定試劑盒(尿酸酶比色法)，批號：20171201，黃嘌呤氧化酶(XOD)測試盒，批號：20180122，尿素氮試劑盒(脲酶法)，批號：20171103，肌酐試劑盒，批號：20171102，考馬斯亮藍試劑盒，批號：20171219，腺苷脫氨酶(ADA)試劑盒，批號：20180122，均購自南京建成生物工程研究所。

AL204電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；SPS2001F電子天平(奧豪斯公司)；TGL-16C臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；UV-2000紫外分光光度計(尤尼柯)；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(金壇市醫(yī)療儀器廠)；Eclipse Ci光學顯微鏡(尼康公司)；ASP 200S全自動脫水機，5300全自動染封一體機，RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(德國徠卡公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑的配制

用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)做溶媒，分別配制20 mg/mL氧嗪酸鉀混懸液、33.33 mg/mL次黃嘌呤混懸液、30 mg/mL次黃嘌呤和12.5 mg/mL乙胺丁醇混合溶液、12.5 mg/mL乙胺丁醇和5 mg/mL腺嘌呤混合溶液、1.5 g/mL酵母膏混懸液、1.5 g/mL酵母膏和5 mg/mL腺嘌呤混合溶液。

1.3.2 動物分組與造模

將小鼠隨機分為正常組Ⅰ、正常組Ⅱ、正常組Ⅲ、模型A組(氧嗪酸鉀)、模型B組(氧嗪酸鉀)、模型C組(次黃嘌呤+氧嗪酸鉀)、模型D組(次黃嘌呤+乙胺丁醇+氧嗪酸鉀)、模型E組(乙胺丁醇+腺嘌呤)、模型F組(酵母膏+氧嗪酸鉀)、模型G組(酵母膏+腺嘌呤+氧嗪酸鉀)，每組10只，正常組給予0.5% CMC-Na灌胃，模型組具體造模方法見表1。造模期間，各組小鼠自由飲水，喂飼相同質(zhì)量的飼料。

1.3.3 檢測指標

每天觀察小鼠的一般情況并稱重，計算每只小鼠的體重相對變化率(%)=(每次稱量體重/實驗開始時體重)× 100。

各組小鼠分別在末次造模后1 h或2 h眼球取血，室溫靜置1～2 h后3500 r/min離心10 min，取血清，凍存于-20℃?zhèn)溆?，按照試劑盒的操作說明測定血清中尿酸、尿素氮、肌酐水平。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟，進行勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒操作說明測定上清液肝臟黃嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脫氨酶(ADA)活性。

1.3.4 腎臟病理組織學檢查

實驗結(jié)束后，摘取全腎組織，用10%福爾馬林溶液固定。選取血尿酸、腎功能異常的造模組小鼠以及正常組腎組織進行脫水、石蠟包埋、制片(4 μm厚)、HE染色、光學顯微鏡觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重變化

造模7 d過程中，模型D、E組小鼠體重均呈上升趨勢，但與正常組Ⅱ相比，差異均無顯著性(P> 0.05)，結(jié)果見圖1。

造模14 d過程中，模型F、G組小鼠體重均呈上升趨勢，但與正常組Ⅲ相比，差異均無顯著性(P> 0.05)；在造模第14天，模型F組與模型G組相比體重顯著增加(P< 0.05)。結(jié)果見圖2。

表1 動物分組與造模(n=10)Table 1 Test groups and the different schemes of animal modeling

注：“ig”表示灌胃；“ip”表示腹腔注射；“sc”表示皮下注射。

Note. “ig” means intragastric administration; “ip” means intraperitoneal injection; and “sc” means hypodermic injection.

2.2 各組小鼠血清尿酸、尿素氮及肌酐水平的變化

由表2可知，采用單次造模，與正常組Ⅰ相比，模型C組小鼠血清尿酸水平及尿素氮顯著增高(P< 0.01)，模型A組與模型B組小鼠血清尿酸、尿素氮及肌酐變化均不明顯，差異無顯著性(P> 0.05)。模型A組與模型B組比較，兩者血清尿酸、尿素氮、肌酐水平差異均無顯著性(P> 0.05)，說明取血時間不影響氧嗪酸鉀單次造模結(jié)果。

由表3可知，采用連續(xù)7 d造模方法，與正常組Ⅱ相比，模型D組血清尿酸水平顯著升高(P< 0.01)，模型E組血清尿酸水平有所降低，但差異無顯著性(P> 0.05)；模型D組和模型E組血清尿素氮值均顯著增高(P< 0.01)，但兩組血清肌酐值差異均無顯著性(P> 0.05)。

由表4可知，采用連續(xù)14 d造模方法，與正常組Ⅲ相比，模型F組和模型G組小鼠血清尿酸、尿素氮以及肌酐值均顯著升高(P< 0.01)。

2.3 各組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脫氨酶(ADA)活性的變化

由表5可知，與正常組Ⅰ比較，模型A、B、C組肝臟的XOD和ADA活性升高不明顯，差異均無顯著性(P> 0.05)。模型A組與模型B組比較，差異亦無顯著性(P> 0.05)。

圖1 連續(xù)7 d造模各組小鼠體重變化情況Figure 1 Changes in the relative mouse body weight of each group after 7-day consecutive modeling

注：與模型G組比較，*P< 0.05。圖2 連續(xù)14 d造模各組小鼠體重變化情況Note. Compared with the model group G,*P< 0.05.Figure 2 Changes in the relative mouse body weight of each group after 14-day consecutive modeling

組別Groups血清尿酸(mg/L)Serum uric acid尿素氮(mmol/L)Urea nitrogen肌酐(μmol/L)Creatinine正常組ⅠNormal group Ⅰ32.26±3.677.69±1.22125.53±22.04模型A組Model group A37.40±5.867.62±1.34120.56±22.66模型B組Model group B44.79±9.646.97±1.08115.51±24.43模型C組Model group C104.20±38.00##9.46±1.65##127.78±34.38

注：與正常組Ⅰ比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the normal group Ⅰ,#P< 0.05,##P< 0.01.

表3 連續(xù)7 d造模各組小鼠血清尿酸、尿素氮及肌酐水平變化情況Table 3 Changes in serum uric acid, urea nitrogen, and creatinine of the mice in each group after 7-day consecutive modeling

注：與正常組Ⅱ比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the normal group Ⅱ,#P< 0.05,##P< 0.01.

由表6可知，采用連續(xù)7 d造模方法，與正常組Ⅱ比較，模型D組小鼠肝臟XOD活性明顯降低(P< 0.05)，但ADA活性升高不明顯，差異無顯著性(P> 0.05)；模型E組的肝臟XOD和ADA活性差異均無顯著性(P> 0.05)。

由表7可知，采用連續(xù)14 d造模方法，與正常組Ⅲ比較，模型F組、模型G組小鼠肝臟XOD和ADA活性差異均無顯著性(P> 0.05)。

表4 連續(xù)14 d造模各組小鼠血清尿酸、尿素氮及肌酐水平變化情況Table 4 Changes in serum uric acid, urea nitrogen, and creatinine of the mice in each group after 14-day consecutive modeling

注：與正常組Ⅲ比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the normal group Ⅲ,#P< 0.05,##P< 0.01.

表5 單次造模各組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶活性變化情況Table 5 Changes in liver xanthine oxidase activity and adenosine deaminase activity of the mice in each group after single modeling

表6 連續(xù)7 d造模各組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶活性變化情況Table 6 Changes in liver xanthine oxidase activity and adenosine deaminase activity of the mice in each group after 7-day consecutive modeling

注：與正常組Ⅱ比較，#P< 0.05。

Note. Compared with the normal group Ⅱ,#P< 0.05.

表7 連續(xù)14 d造模各組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶活性變化情況Table 7 Changes in liver xanthine oxidase activity and adenosine deaminase activity of the mice in each group after 14-day consecutive modeling

2.4 腎臟組織病理學檢測

注：a：正常組腎髓質(zhì)；b：正常組腎小管；c：模型C組腎皮質(zhì)；d：模型C組腎髓質(zhì)；e：模型D組腎皮質(zhì)；f：模型D組腎髓質(zhì)；g：模型E組腎皮質(zhì)；h：模型E組腎髓質(zhì)；i：模型F組腎皮質(zhì)；j：模型F組腎髓質(zhì)；k：模型G組腎皮質(zhì)；l：模型G組腎髓質(zhì)。黑色箭頭指示嗜酸性不溶性蛋白；紅色箭頭指示鹽類結(jié)晶；藍色箭頭指示腎小管上皮細胞水腫；黃色箭頭指示腎小管上皮細胞壞死；綠色箭頭指示核固縮、碎裂，腎小管擴張；橙色箭頭指示腎小管核碎裂狀的細胞；紫色箭頭指示腎小管上皮細胞脫落。標尺=50 μm。圖3 各組小鼠腎臟組織病理改變(HE染色，× 200)Note. a: Renal medulla in normal group. b: Renal tubule in normal group. c: Renal cortex in model group C. d: Renal medulla in model group C. e: Renal cortex in model group D. f: Renal medulla in model group D. g: Renal cortex in model group E. h: Renal medulla in model group E. i: Renal cortex in model group F. j: Renal medulla in model group F. k: Renal cortex in model group G. l: Renal medulla in model group G. Black arrow indicates eosinophilic insoluble protein. Red arrow indicates salt crystal. Blue arrow indicates renal tubular epithelial cell edema. Yellow arrow indicates renal tubular epithelial cell necrosis. Green arrow indicates nuclear pyknosis and fragmentation, and tubular dilation. Orange arrow indicates renal tubular cells with nuclear fragmentation. Purple arrow indicates renal tubular epithelial cell shedding. Bars=50 μm.Figure 3 Pathological changes of the renal tissues of the mice in each group. HE staining

選取正常組及模型C、D、E、F、G組的腎組織進行病理組織學檢查，結(jié)果表明，正常組腎髓質(zhì)皮質(zhì)分界清晰，腎小球毛細血管襻結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細胞結(jié)構(gòu)正常，腎小管刷狀緣排列整齊規(guī)則，未見明顯炎癥反應(yīng)；模型C組腎皮質(zhì)中腎小球毛細血管襻結(jié)構(gòu)清晰，多見腎小管管型，近曲小管內(nèi)可見嗜酸性不溶性蛋白，腎髓質(zhì)中小管中少見嗜酸性不溶性蛋白，多見鹽類結(jié)晶；模型D組腎皮質(zhì)中部分近曲小管內(nèi)可見嗜酸性不溶性蛋白，腎髓質(zhì)中未見明顯鹽類結(jié)晶；模型E組腎皮質(zhì)中多見腎小管上皮細胞水腫，少見腎小管上皮細胞壞死、核固縮、碎裂，少量腎小管擴張，腎髓質(zhì)中少量小管中可見核碎裂狀的細胞；模型F組腎皮質(zhì)中部分腎小管上皮細胞脫落，部分近曲小管內(nèi)可見嗜酸性不溶性蛋白，腎髓質(zhì)中未見明顯鹽類結(jié)晶；模型G組腎皮質(zhì)中腎小球毛細血管襻結(jié)構(gòu)清晰，腎小管無明顯異常，腎髓質(zhì)小管中多見鹽類結(jié)晶，結(jié)果見圖3。

3 討論

人體產(chǎn)生的尿酸約有2/3經(jīng)腎臟隨尿液排出，因此，高尿酸血癥可導致腎功能的減退[5]。高尿酸血癥引起的腎實質(zhì)損害有三種類型[2]：①痛風性腎病，是由于長期輕中度高尿酸血癥所致的腎臟損害，主要表現(xiàn)為痛風石沉積于皮髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)深部呈慢性間質(zhì)性炎癥，導致腎臟縮小、瘢痕化；②尿酸性腎病，是大量尿酸鹽結(jié)晶短時間沉積于腎臟集合管、腎盂及輸尿管并堵塞腎小管，引起腎小管近端擴張，導致腎功能急性、嚴重損傷，引發(fā)急性腎功能衰竭；③尿酸結(jié)石，是由尿酸鹽結(jié)晶形成的結(jié)石沉積于腎乳頭和集合管內(nèi)引起結(jié)石性梗阻。

尿酸是大多數(shù)動物體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物，主要由黃嘌呤氧化酶(XOD)催化次黃嘌呤與黃嘌呤而產(chǎn)生，文獻中常用以下方法建立高尿酸血癥腎損害小鼠模型[6]：①抑制尿酸分解，尿酸酶為嘌呤代謝酶，可以將尿酸轉(zhuǎn)化成尿囊素排出體外。氧嗪酸鉀是尿酸酶抑制劑，通過抑制尿酸酶活性，使小鼠血尿酸水平升高。大鼠、小鼠等嚙齒類動物體內(nèi)存在尿酸酶，但人體內(nèi)沒有此酶，故采用氧嗪酸鉀制備高尿酸血癥腎損害模型，即使造模成功此方法也與人類高尿酸血癥發(fā)病機制不盡相符。②增加尿酸的前體物質(zhì)，如腺嘌呤、酵母膏、次黃嘌呤等。給予大劑量的腺嘌呤可以增強體內(nèi)黃嘌呤氧化酶活性以及促進谷酰胺磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)移酶的合成，加快尿酸的生成，同時異常高濃度的腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)闃O難溶于水的2, 8-二羥基腺嘌呤，沉積于腎小管，引起腎小管阻塞，進而導致血清尿酸、肌酐、尿素氮顯著上升[7]。給予酵母膏，正常的嘌呤代謝受到大量含豐富蛋白質(zhì)類的酵母的影響，致使嘌呤代謝開始紊亂，從而誘發(fā)高尿酸血癥，由于血尿酸濃度的升高出現(xiàn)腎小管功能異常，漸至腎小球的損害而造成腎功能受損[8-9]；給予次黃嘌呤，它在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸前體物質(zhì)黃嘌呤，進而形成尿酸。③抑制尿酸排泄，乙胺丁醇其代謝產(chǎn)物吡嗪酸可抑制腎小管對尿酸的分泌，從而抑制腎臟對尿酸的排泄使血尿酸升高[10]。

本研究使用氧嗪酸鉀、次黃嘌呤、腺嘌呤、乙胺丁醇、酵母膏5種造模劑，單用或聯(lián)用這些造模劑，即單用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀；聯(lián)用尿酸前體物質(zhì)(次黃嘌呤、酵母膏或腺嘌呤)和尿酸酶抑制劑(氧嗪酸鉀)；聯(lián)用尿酸前體物質(zhì)(腺嘌呤)和抑制尿酸排泄藥(乙胺丁醇)；聯(lián)用尿酸前體物質(zhì)(次黃嘌)、尿酸酶抑制劑(氧嗪酸鉀)以及抑制尿酸排泄藥(乙胺丁醇)。觀察不同造模機制、造模時間、造模劑量對病理模型的影響，從而設(shè)定了7個造模組。

本研究用氧嗪酸鉀400 mg/kg單次腹腔注射，造模后1 h和2 h取血，其尿酸水平與正常組相比無明顯差異，造模不成功，文獻也報道此種造模方法不穩(wěn)定，重復(fù)性不好[11-12]。本研究采用500 mg/kg次黃嘌呤與300 mg/kg氧嗪酸鉀聯(lián)合單次給藥造模，小鼠血清尿酸及尿素氮水平顯著升高，腎臟組織病理學檢查也發(fā)現(xiàn)其腎小管受損伴有尿酸鹽結(jié)晶沉積，說明此造模方式可誘導高尿酸血癥并對腎功能有一定損害，與文獻報道相符[13]，但此方法為單次造模，可觀察預(yù)防性給藥的療效，對治療性用藥的療效無法觀察。

本研究采用250 mg/kg乙胺丁醇與100 mg/kg腺嘌呤連續(xù)7 d造模，血清尿酸水平與正常組相比沒有明顯變化，但尿素氮水平顯著升高，組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)其腎皮質(zhì)中可見腎小管上皮細胞水腫，少量腎小管上皮細胞壞死，核固縮、碎裂，少量腎小管擴張，腎髓質(zhì)中少量小管中可見核碎裂狀的細胞，此種造模方法可造成顯著的腎功能損害，考慮是由造模劑直接引起腎功能損傷，與高尿酸血癥導致腎損害病理機制不符。

施琬等[14]采用25 g/kg次黃嘌呤飼料喂養(yǎng)聯(lián)合250 mg/kg乙胺丁醇灌胃，同時皮下注射200 mg/kg氧嗪酸鉀制備高尿酸血癥大鼠模型，Han等[15]采用100 mg/kg次黃嘌呤聯(lián)合250 mg/kg乙胺丁醇灌胃，同時皮下注射200 mg/kg氧嗪酸鉀，連續(xù)17 d，制備大鼠高尿酸血癥腎損害模型，其血清尿酸、尿素氮、肌酐水平均顯著升高，組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)明顯的腎功能損害。由于飼料中加用次黃嘌呤，其造模劑量不可控，且本研究采用小鼠進行造模，因此將次黃嘌呤改為用600 mg/kg直接灌胃，并與乙胺丁醇和氧嗪酸鉀聯(lián)合造模7 d，結(jié)果表明小鼠血清尿酸、尿素氮水平均明顯升高，組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)腎臟近曲小管內(nèi)可見嗜酸性不溶性蛋白，此造模方法能夠造成小鼠高尿酸血癥性腎損害，但該模型中小鼠肝臟XOD活性顯著降低，有文獻報道肝臟中XOD活性降低時伴隨血清中XOD活性升高[16]，因此考慮其血清中XOD有變化，這提示應(yīng)同時測定血清中XOD活性。此種造模方式小鼠精神狀態(tài)不佳，體重無明顯降低，同時乙胺丁醇競爭性抑制腎小管分泌尿酸，導致腎臟受損，因此采用乙胺丁醇造模不符合高尿酸血癥腎損害臨床發(fā)病機制[17]。

本研究采用30 g/kg酵母膏+ 300 mg/kg氧嗪酸鉀聯(lián)合和30 g/kg酵母膏+ 100 mg/kg腺嘌呤+ 300 mg/kg氧嗪酸鉀聯(lián)用連續(xù)14 d造模，結(jié)果表明小鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐水平均明顯升高，腎臟組織病理觀察發(fā)現(xiàn)酵母膏+氧嗪酸鉀聯(lián)用組腎小管上皮細胞脫落，部分近曲小管內(nèi)可見嗜酸性不溶性蛋白，酵母膏+腺嘌呤+氧嗪酸鉀聯(lián)用組小鼠腎髓質(zhì)小管中多見鹽類結(jié)晶，兩種造模方法均可造成顯著的腎功能損害，但是酵母膏+氧嗪酸鉀組小鼠體重較酵母膏+腺嘌呤+氧嗪酸鉀組顯著增加，而且腺嘌呤可導致大鼠慢性腎功能疾病[18-19]，其造模引起的腎臟病變也并非全因高尿酸血癥引發(fā)，故采用酵母膏和氧嗪酸鉀聯(lián)用長期造模方式更為合適。

綜上所述，單次造模對小鼠腎臟損傷不大，而長期造模均能夠?qū)е滦∈竽I臟損害，因此筆者建議采用酵母膏和氧嗪酸鉀聯(lián)合連續(xù)14 d造模建立小鼠高尿酸血癥腎損害模型更合適。