植物乳桿菌S72對(duì)高達(dá)干酪品質(zhì)的影響

段翠翠，趙子健，趙玉娟，王超，高磊，牛春華，李盛鈺

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長(zhǎng)春 130033）

0 引 言

益生菌作為輔助發(fā)酵劑添加到干酪加工過(guò)程中，對(duì)于干酪的成熟具有積極的作用[1]。益生菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，可以抑制有害微生物的生長(zhǎng)和致病菌的存活，益生菌還可分解某些有害物質(zhì)和毒素，有利于提高發(fā)酵食品的食用安全性[2]。益生菌可以改善干酪的風(fēng)味，通過(guò)乳糖代謝等作用產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)形成獨(dú)特的感官特性；益生菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生有益物質(zhì)如氨基酸、多肽、脂肪酸、礦物質(zhì)等，豐富了干酪的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]。益生菌干酪有益于人體健康，可調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡、改善腸道感染、控制膽固醇含量、提高機(jī)體免疫力及抑制有害物質(zhì)積累，因此具有潛在的藥用價(jià)值[4]。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的一株具有潛在益生特性和優(yōu)良發(fā)酵功能特性的菌株作為益生菌輔助發(fā)酵劑應(yīng)用于高達(dá)干酪的加工中，并研究益生菌對(duì)高達(dá)干酪品質(zhì)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株及發(fā)酵劑制備

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）S72來(lái)源于長(zhǎng)白山地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸菜，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有膽固醇清除能力、抗氧化特性及蛋白水解活性，保存于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所菌種庫(kù)中。商品發(fā)酵劑為R 707干酪專(zhuān)用發(fā)酵劑（丹麥CHR HAN-SEN公司）。

L.plantarumS72在12%（V/V）脫脂乳培養(yǎng)基中連續(xù)傳代活化后，按3%（V/V）接種于12%（V/V）脫脂乳中，37℃靜置培養(yǎng)16 h，離心（5 000 rpm，4℃，10 min），菌泥用滅菌生理鹽水洗滌兩次，離心（5 000 rpm，4℃，10 min），滅菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為1.0×107cfu/mL，4℃冰箱保藏備用。作為干酪加工的輔助發(fā)酵劑，添加量為8.0×106cfu/mL。商品發(fā)酵劑的添加量按照說(shuō)明書(shū)確定。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋（日本Sanyo公司），CK2TRC-3顯微鏡（日本Olympus公司），BCN-1360B無(wú)菌超凈工作臺(tái)（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），HZQ-Q電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），梅特勒-托利多Delta320 p H計(jì)（瑞士梅特勒-托利多有限公司），TAXT plus型質(zhì)構(gòu)儀（英國(guó)Stable Micro System公司），HP1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司），6890N-5973N氣-質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 益生菌高達(dá)干酪的制作工藝流程

原料乳→過(guò)濾→65℃加熱30 min（巴氏殺菌）→冷卻至30℃→加入商品發(fā)酵劑（0.03 g/L）和L.plantarumS72輔助發(fā)酵劑（8.0×106cfu/mL）→30℃，發(fā)酵 30-45 min→加凝乳酶（0.033 g/L）和氯化鈣溶液（0.2 g/L）→30℃，凝乳30～45 min→切割→攪拌15～25 min→熱燙→排乳清→預(yù)壓榨2～4 kg/cm2，15～20 min→成型→壓榨4～6 kg/cm2，1～2 h→加鹽（2%，W/W）→貯存→包裝→4℃成熟

1.2.2 干酪理化指標(biāo)的測(cè)定

水分含量測(cè)定：參照GB5009.003-2010《食品中水分的測(cè)定》；脂肪的測(cè)定：參照AOAC905.02（1990）羅紫-哥特里（Rse-Gottlieb）法；蛋白含量測(cè)定：參照AOAC920.123（1990）凱氏定氮（Kjeldahl）法。

1.2.3 干酪pH值的測(cè)定

稱(chēng)取10 g Gouda干酪碎塊，加入12 mL溫度為50℃的蒸餾水，在20℃條件下，20 000 rpm勻漿1 min。于50℃水浴鍋靜置30 min，離心（5 000g，10 min，20℃），用pH計(jì)測(cè)量數(shù)值[5]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 干酪微生物指標(biāo)的測(cè)定

稱(chēng)取0.5 g Gouda干酪，無(wú)菌操作下研碎，無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋?zhuān)坎加贛RS固體培養(yǎng)基和M 17固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，平板計(jì)數(shù)[6]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 干酪質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

分別取成熟0周和12周的干酪樣品，室溫下放置2 h，利用TAXT plus型質(zhì)構(gòu)儀對(duì)干酪進(jìn)行TPA分析。測(cè)量前探頭下降速度為1.0 mm/s；測(cè)試速度為1.0 mm/s；測(cè)量后探頭回程速度為5.0 mm/s；下壓變形為10 mm；觸發(fā)力為0.2 N；探頭類(lèi)型為p/5。

1.2.6 水溶性氮（WSE/TN）含量測(cè)定

稱(chēng)取20.0 g Gouda干酪碎塊，加入40 mL蒸餾水（50℃）勻漿（20 000 rpm，1 min）。40℃水浴鍋靜置1 h，離心（5000×g，15 min，20℃），上清定容至100 mL。取10 mL溶液消化后凱氏定氮[7]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 70%乙醇可溶性氮（70%Ethanol-SN）含量測(cè)定

20 mL WSE-SN溶液添加46.7 mL無(wú)水乙醇，震蕩混勻后，室溫提取 1 h，離心（5 000×g，15 min，20℃），上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15 min，加蒸餾水定容至50 mL。取10 mL溶液進(jìn)行消化后凱氏定氮[8]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 5%磷鎢酸可溶性氮（PTA-SN）含量測(cè)定

10 mL WSE-SN溶液依次添加7 mL 3.95 mol/L硫酸溶液和3 mL 33.3%（V/V）磷鎢酸溶液，震蕩混勻后，4℃靜置過(guò)夜。離心（5 000×g，15 min，20℃），過(guò)濾，上清用蒸餾水定容至25 mL。取10 mL溶液凱氏定氮[9]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 干酪游離氨基酸成分的測(cè)定

取成熟12周的Gouda干酪研碎，稱(chēng)取30 mg樣品，加20 mL 6 mol/L鹽酸和100μL巰基乙醇，混合均勻，充氮?dú)? min，密封水解管，置于110℃水解24 h。水解完成，取0.3 mL水解液，試管濃縮儀真空蒸發(fā)至干燥（60℃），溶于3 mL樣品稀釋液中，離心，上清經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，利用氨基酸分析儀檢測(cè)干酪中的游離氨基酸。

分析條件：分析柱LCAK06/Na(150×4.6 mm)，梯度洗脫，循環(huán)時(shí)間為58 min，分離柱溫度58℃，反應(yīng)株溫度130℃，緩沖液流速0.4 mL/min，茚三酮衍生液流速0.25 mL/min，洗脫液流速0.45 mL/min，紫外檢測(cè)器，脯氨酸紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：440 nm，除脯氨酸外其他氨基酸紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：570 nm

1.2.10 干酪中脂肪酸成分的測(cè)定

取成熟12周的Gouda干酪研碎。游離脂肪酸的提取和甲酯化參考Aldo等的方法操作[10]。采用GC-MS方法進(jìn)行樣品分析。色譜條件：氣相色譜6 890 N；彈性石英毛細(xì)管柱為SE-54，30 m×0.25 mm×0.25μm；氣化室溫度250℃；程序升溫80～290℃(4℃/min)，恒溫 30 min；載氣 He；載氣流量 1.2 mL/min；線(xiàn)速度40 cm/s；容積延遲3 min；進(jìn)樣量1μL。各組分經(jīng)過(guò)GC/MS分析，各峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖與美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)NIST02L對(duì)照檢索，確定出化合物類(lèi)型，用內(nèi)標(biāo)法確定各脂肪酸成分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 L.plantarum S72對(duì)干酪基本理化指標(biāo)的影響

由表1的結(jié)果可以看出，對(duì)照組Gouda干酪與添加L.plantarumS72作為輔助發(fā)酵劑制備的Gouda干酪，在理化成分上稍有差異。

商品發(fā)酵劑對(duì)照組Gouda干酪和添加L.plantarumS72的Gouda干酪的pH值相差不大，在干酪成熟期中pH值均略有下降。在成熟過(guò)程中，添加L.plantarumS72的Gouda干酪和商品發(fā)酵劑組干酪相比，蛋白質(zhì)、脂肪含量及脂肪占干物質(zhì)的含量（Fat in Dry Matter：FDM）比值無(wú)顯著變化。相關(guān)研究也表明在成熟過(guò)程中，干酪的理化性質(zhì)（蛋白、脂肪含量，濕度，pH等）不會(huì)發(fā)生顯著變化[11]。

表1 L.plantarum S72對(duì)干酪理化指標(biāo)的影響

2.2 L.plantarum S72對(duì)干酪質(zhì)構(gòu)的影響

Gouda干酪的質(zhì)構(gòu)與干酪的組織結(jié)構(gòu)及狀態(tài)有關(guān)，它決定了干酪的口感、滋味等。由表2的結(jié)果可以看出，隨著干酪的成熟，干酪的硬度逐漸增加，添加L.plantarumS72的Gouda干酪與商品發(fā)酵劑組Gouda干酪的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)基本一致，這說(shuō)明在Gouda干酪的加工中加入益生菌對(duì)于干酪本身的硬度、咀嚼度、彈性等方面無(wú)顯著影響。Daigle等將鼠李糖乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌添加到農(nóng)家干酪中，不但獲得了較高的活菌數(shù)，而且對(duì)農(nóng)家奶酪的硬度、咀嚼度等產(chǎn)品品質(zhì)沒(méi)有不良影響[12-13]。而Sheehan等的研究結(jié)果表明，加入具有蛋白水解能力的菌株后，干酪的硬度及彈性顯著低于對(duì)照組，尤其是在成熟期大于60 d以后[14]。

表2 干酪成熟過(guò)程中質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的變化

2.3 Gouda干酪成熟過(guò)程中活菌數(shù)的變化

表3 干酪成熟過(guò)程中微生物指標(biāo)分析

由表3的結(jié)果可以看出，在干酪成熟過(guò)程中商品發(fā)酵劑對(duì)照組和S72組干酪球菌存活數(shù)差異不顯著，隨干酪成熟時(shí)間延長(zhǎng)活菌數(shù)逐漸降低。添加L.plantarumS72干酪成熟2周后，乳桿菌活菌數(shù)由9.38±0.14 Log cfu/g增加到10.59 Log cfu/g，隨成熟期的延長(zhǎng)活菌數(shù)逐漸下降，但成熟12周干酪中乳桿菌活菌數(shù)為9.40 Log cfu/g，說(shuō)明Gouda干酪有助于益生性性乳桿菌的存活。Lynch[15]等的研究表明，在切達(dá)干酪制作過(guò)程中加入輔助發(fā)酵劑后，輔助發(fā)酵劑菌株保持較高的活菌數(shù)，且不影響球菌主發(fā)酵劑菌株的存活，我們的研究結(jié)果與其一致。

2.4 Gouda干酪成熟過(guò)程中水溶性氮（WSE/TN）含量的變化

本實(shí)驗(yàn)利用水溶性氮占總氮的百分比（WSE/TN）確定干酪的初級(jí)蛋白水解程度，并作為Gouda干酪成熟程度的指標(biāo)。此外，干酪中的大部分風(fēng)味物質(zhì)都在水溶性氮中[16]。由圖1可知，成熟期間對(duì)照組干酪的WSN/TN比值由2.03%增加至8.12%，在成熟過(guò)程中，各階段相差不大。而商品發(fā)酵劑+S72組干酪的WSN/TN比值均高于商品發(fā)酵劑組干酪，是因?yàn)橐嫔鶯.plantarumS72具有較高的蛋白水解活性，能促進(jìn)蛋白質(zhì)水解成氨基酸和多肽。相關(guān)研究也表明隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，奶酪中的可溶性氮含量增加，并且在180 d達(dá)到最大值[11]。

圖1 干酪成熟過(guò)程中水溶性氮的變化

2.5 Gouda干酪成熟過(guò)程中70%乙醇可溶性氮（70%Ethanol-SN）含量的變化

圖2 干酪成熟過(guò)程中70%乙醇可溶性氮的變化

如圖2所示，在Gouda干酪成熟過(guò)程中，試驗(yàn)組干酪70%Ethanol-SN比值均略高于對(duì)照組。70%乙醇可溶性氮中含有氨基酸、大分子肽類(lèi)及含氮化合物等物質(zhì)。研究結(jié)果表明，Gouda干酪加工過(guò)程中添加L.plantarumS72益生菌株會(huì)提高干酪中各種功能性肽含量。本研究中，我們的檢測(cè)結(jié)果表明干酪后熟時(shí)間為12周時(shí)，70%Ethanol-SN的數(shù)值達(dá)到最高，推測(cè)隨著后熟時(shí)間延長(zhǎng)，70%Ethanol-SN數(shù)值仍然會(huì)增加。進(jìn)一步分析深層原因可能是在干酪后熟過(guò)程中，中等分子量的多肽和酪蛋白逐漸被各種酶類(lèi)分解成低分子量的多肽和氨基酸，而后者可溶于70%乙醇中。Pappa等的研究表明在奶酪后熟期間，高分子量及中分子量多肽和酪蛋白被乳酸菌自溶釋放的各種酶水解成低分子量多肽和氨基酸等物質(zhì)，而這些物質(zhì)可溶解于70%乙醇，所以70%Ethanol-SN成分會(huì)增加[17]。這與我們的推測(cè)一致。

2.6 Gouda干酪成熟過(guò)程中5%磷鎢酸可溶性氮（PTA-SN）含量的變化

由圖3可知，5%磷鎢酸可溶性氮（PTA-SN）含量的變化與70%Ethanol-SN相似，在Gouda干酪成熟過(guò)程中5%PTA-SN的含量也呈增加趨勢(shì)，商品發(fā)酵劑+S72組干酪5%PTA-SN含量高于商品發(fā)酵劑組。5%PTA-SN中含有游離氨基酸、小分子量肽類(lèi)和小分子量含氮化合物組成。根據(jù)我們的檢測(cè)數(shù)據(jù)（待發(fā)表），L.plantarumS72肽酶活性較強(qiáng)，有助于酪蛋白酶解生成游離氨基酸和肽類(lèi)物質(zhì)，從而增加5%PTA-SN的含量。說(shuō)明L.plantarumS72益生菌作為輔助發(fā)酵劑，具有促進(jìn)蛋白水解的作用。

圖3 干酪成熟過(guò)程中5%磷鎢酸可溶性氮的變化

2.7 Gouda干酪成熟過(guò)程中游離氨基酸含量的變化

Gouda干酪中的游離氨基酸含量能夠直接影響干酪的味道和風(fēng)味。干酪成熟過(guò)程中，乳酸菌自溶，釋放出具有各種肽酶，將小肽進(jìn)一步分解生成游離氨基酸。圖4是商品發(fā)酵劑制備的Gouda干酪和添加L.plantarumS72作為輔助發(fā)酵劑制備的Gouda干酪在成熟12周后對(duì)其游離氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。商品發(fā)酵劑+S72組干酪中各種游離氨基酸的含量均高于商品發(fā)酵劑組。添加L.plantarumS72后，提高了Gouda干酪成熟期間游離氨基酸含量，這有助于增加Gouda干酪的風(fēng)味。與我們的研究結(jié)果相似，Sonia等的研究結(jié)果表明，加入輔助發(fā)酵劑后，干酪中的總游離氨基酸量略高于未添加輔助發(fā)酵劑組[18]。

Asp：天門(mén)冬氨酸；Thr：蘇氨酸；Ser：絲氨酸；Glu：谷氨酸；Ala：丙氨酸；Val：纈氨酸；Met：蛋氨酸；Ile：異亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：組氨酸；Lys：賴(lài)氨酸；Arg：精氨酸；Pro：脯氨酸

圖4 植物乳桿菌S72對(duì)干酪中游離氨基酸組分的影響

2.8 Gouda干酪成熟過(guò)程中脂肪酸含量的變化

干酪中的脂肪酸和氨基酸是主要的風(fēng)味前體物質(zhì)，對(duì)Gouda干酪形成特有的風(fēng)味發(fā)揮重要作用。干酪中的脂肪酸不但是直接的風(fēng)味化合物，而且是第二大主要風(fēng)味物質(zhì)甲基酮形成的底物。圖5是兩組干酪在成熟12周后脂肪酸含量的測(cè)定結(jié)果，從圖中可以看出，商品發(fā)酵劑組干酪和添加L.plantarumS72的Gouda干酪脂肪酸組成和含量差別不大。其中棕櫚酸和油酸含量較高，均超過(guò)25%，棕櫚油酸、亞油酸和亞麻酸相對(duì)百分含量均低于5%。研究表明在美國(guó)生產(chǎn)的切達(dá)干酪中添加食品級(jí)脂肪酶有助于其強(qiáng)烈風(fēng)味的形成。而當(dāng)干酪中的脂肪酸高于正常水平時(shí)，將在干酪成熟的任何階段都有損風(fēng)味的平衡而不能形成特征風(fēng)味，干酪中游離脂肪酸含量從0.3～100 mg/kg能很好的促進(jìn)干酪的風(fēng)味[19]。

圖5 L.plantarum S72對(duì)干酪中游離脂肪酸的影響

3 結(jié)論

綜上所述，L.plantarumS72作為益生菌和輔助發(fā)酵劑應(yīng)用于Gouda干酪中，L.plantarumS72對(duì)干酪的一般理化指標(biāo)、質(zhì)構(gòu)特性等無(wú)顯著影響，但在干酪成熟期間保持較高的活菌數(shù)。添加L.plantarumS72的Gouda干酪中WSE/TN，70%Ethanol-SN，5%PTA-SN和游離氨基酸的含量高于商品發(fā)酵劑組干酪，說(shuō)明L.plantarumS72有助于干酪促熟和風(fēng)味的形成。L.plantarumS72是一株在干酪加工中有較好應(yīng)用前景的益生菌輔助發(fā)酵菌株。