美拉德反應(yīng)對(duì)褐色益生菌羊乳飲料品質(zhì)的影響

劉婕，姜竹茂，劉曉，單靜，艾春梅

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)，264005）

0 引 言

羊奶業(yè)是我國(guó)奶業(yè)的重要組成部分，是部分地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)[1]。羊奶被稱(chēng)為“奶中之王”，營(yíng)養(yǎng)組成和功能作用與母乳相接近，具有獨(dú)特的生物活性性質(zhì)，乳脂肪球和酪蛋白膠粒較小，更易于人體消化吸收，可作為牛乳治療營(yíng)養(yǎng)不良兒童的最佳替代品[2-3]。褐色乳酸菌飲料是一種風(fēng)味獨(dú)特、口感清爽的乳飲料，是脫脂牛乳與還原糖在高溫殺菌的過(guò)程中發(fā)生了一定程度的美拉德反應(yīng)而呈現(xiàn)褐色，再經(jīng)用干酪乳桿菌或其他益生菌長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵、破乳、調(diào)配、均質(zhì)、灌裝等而制成的一種發(fā)酵型乳酸菌飲料[4-5]。益生菌是一類(lèi)能對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生有益作用，可以改善腸道微生物平衡，促進(jìn)腸道健康，從而提高宿主的免疫調(diào)節(jié)功能[6-9]。目前我國(guó)羊奶產(chǎn)品較為單一，主要以傳統(tǒng)的液態(tài)羊奶為主。鑒于褐色乳酸菌飲料市場(chǎng)需求，將羊奶的營(yíng)養(yǎng)功能和益生菌的保健功能相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出具有保健功能的褐色益生菌羊乳飲料具有重要意義。

美拉德反應(yīng)是游離氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)的氨基與還原糖的羰基之間發(fā)生的一種復(fù)雜反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物包括揮發(fā)性香氣物質(zhì)、Strecker醛類(lèi)物質(zhì)和大分子質(zhì)量棕黑色聚合物，這些產(chǎn)物在食品風(fēng)味的形成中起著重要作用[10]，是廣泛存在于食品工業(yè)的一種非酶褐變。美拉德反會(huì)產(chǎn)生各種特殊的風(fēng)味物質(zhì)，形成特殊的焦糖風(fēng)味和色澤，同時(shí)還具有抗氧化等特點(diǎn)[11-14]。發(fā)生美拉德反應(yīng)的過(guò)程十分復(fù)雜，其反應(yīng)受到還原糖種類(lèi)、氨基化合物、溫度、時(shí)間、p H、水分、金屬離子等多重因素的影響[15-16]，因此美拉德反應(yīng)的程度對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)有很大的影響。但是在美拉德反應(yīng)過(guò)程中會(huì)損失蛋白質(zhì)和氨基酸，甚至反應(yīng)條件控制不當(dāng)可能會(huì)產(chǎn)生有害有毒物質(zhì)，比如，蛋白非酶糖基化會(huì)產(chǎn)生一種棕黃色的美拉德反應(yīng)末端產(chǎn)物AGEs，這種物質(zhì)會(huì)增加炎癥，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以造成糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展[17-19]。因此本實(shí)驗(yàn)主要研究了羊乳與不同的還原糖在不同溫度、不同加熱時(shí)間下美拉德反應(yīng)的程度，通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)選擇出最佳的美拉德反應(yīng)條件，為褐色益生菌羊乳飲料的研究與發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純羊奶，市售；葡萄糖、果糖，西王藥業(yè)有限公司；果葡糖漿，山東香馳健源生物科技有限公司；白砂糖，市售；干酪乳桿菌，潤(rùn)盈生物（上海）有限公司；檸檬酸鈉，山東檸檬生化有限公司；穩(wěn)定劑，丹尼斯克（中國(guó)）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 加工工藝

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）褐色發(fā)酵基料的制備：純羊奶脫脂后，加入一定量的還原糖，60℃攪拌15 min使其充分溶解，經(jīng)60℃、20 MPa均質(zhì)后，置于95～98℃水浴中進(jìn)行褐變殺菌120～180 min，降溫至36～38℃，添加4%干酪乳桿菌，混勻后發(fā)酵70～72 h，待發(fā)酵酸度達(dá)到180°T時(shí)終止發(fā)酵，冷卻后，4℃冷藏10～12 h，備用。

（2）褐色益生菌羊乳飲料的制備：用70～80℃凈化水溶解穩(wěn)定劑與白砂糖，高速攪拌使其充分溶解，95℃、15 min殺菌后冷卻至30℃，與褐色發(fā)酵基料混合。用檸檬酸鈉將其pH值調(diào)整至3.6～3.8，酸度控制在60～68°T，調(diào)酸調(diào)香后經(jīng)20 MPa、25℃均質(zhì)，再經(jīng)113℃、5 s殺菌，灌裝，2～6℃冷藏，即得成品。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選擇葡萄糖、果糖、果葡糖漿三種還原糖，考察它們對(duì)褐色益生菌羊乳飲料品質(zhì)的影響，通過(guò)黃藍(lán)值和感官評(píng)價(jià)確定最佳的還原糖；進(jìn)而考察還原糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%）、褐變溫度（86℃、89℃、92℃、95℃、98℃）、褐變時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）等三個(gè)因素對(duì)褐色益生菌羊乳飲料品質(zhì)的影響，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和測(cè)定其黃藍(lán)值。

本產(chǎn)品具有多種強(qiáng)大的功能，比如接垃圾，這一點(diǎn)可以讓人們養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣。再者，智能小桶可以幫助收拾東西的人們緩解心情。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[20-21]，選擇果糖添加量、褐變溫度、褐變時(shí)間為影響因素，以黃藍(lán)值、感官評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，確定最佳的褐變工藝條件。試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

（1）黃藍(lán)值的測(cè)定

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)黃褐色，是食品風(fēng)味的主要來(lái)源之一。測(cè)定褐色益生菌羊乳飲料樣品的黃藍(lán)值可以表示產(chǎn)品中黃褐色產(chǎn)物的相對(duì)濃度，進(jìn)而比較產(chǎn)品的美拉德反應(yīng)程度。樣品黃藍(lán)值越高，美拉德反應(yīng)相對(duì)越充分，產(chǎn)品的風(fēng)味越濃郁[22]。

（2）感官評(píng)價(jià)

隨機(jī)選自10名食品專(zhuān)業(yè)人員對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)定，對(duì)褐色益生菌羊乳飲料按表2評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)定[23-24]。

表2 褐色益生菌羊乳飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 還原糖種類(lèi)的確定

糖是美拉德反應(yīng)重要的影響因素之一，糖的種類(lèi)和結(jié)構(gòu)不同會(huì)產(chǎn)生不同的反應(yīng)速度，同時(shí)也產(chǎn)生不同的風(fēng)味物質(zhì)和色澤[25]。本研究選擇了常見(jiàn)的三種還原糖（葡萄糖、果糖、果葡糖漿）進(jìn)行美拉德反應(yīng)。由圖1可知，還原糖的種類(lèi)對(duì)褐色益生菌羊乳飲料的品質(zhì)和色澤影響較大。果糖的感官評(píng)分最高，果葡糖漿次之，葡萄糖最差。果糖的黃藍(lán)值也最高，顏色的變化也最大，即美拉德反應(yīng)程度最強(qiáng)，果葡糖漿次之。由于果糖溶解度高，溫度越低，甜度越大的特點(diǎn)，更適合于褐色益生菌羊乳飲料，所以選擇果糖作為最佳還原糖來(lái)進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

2.1.2 還原糖添加量的確定

美拉德反應(yīng)主要在羰基化合物（還原糖類(lèi)）和氨基化合物（氨基酸和蛋白質(zhì)）之間發(fā)生縮合、脫水、降解、聚合等一系列的反應(yīng)[26]，因此還原糖的添加量對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有重要的影響。由圖2可知，隨著果糖添加量的增加，褐色益生菌羊乳飲料的感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)果糖添加量為10%時(shí)，感官評(píng)分最高，當(dāng)果糖添加量超過(guò)10%時(shí)，產(chǎn)品口感偏甜，焦糖風(fēng)味濃郁，掩蓋了產(chǎn)品原有的奶香味，感官評(píng)分下降。同時(shí)當(dāng)果糖添加量為10%時(shí)，黃藍(lán)值最大，美拉德反應(yīng)程度最大，但是果糖添加量超過(guò)10%時(shí)，黃藍(lán)值下降，可能由于果糖濃度的增大，果糖分子之間的碰撞幾率增大，引起焦糖化反應(yīng)程度增加，進(jìn)而使美拉德反應(yīng)程度下降，導(dǎo)致黃藍(lán)值減小，因此選擇果糖添加量為10%為最佳果糖添加量。

2.1.3 褐變溫度的確定

美拉德反應(yīng)受溫度的影響很大，溫度相差10℃，褐變速度相差3～5倍[27]。由圖3可知，在選定的溫度范圍內(nèi)，褐色益生菌羊乳飲料的感官評(píng)分先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為95℃時(shí)，感官評(píng)分最高，呈現(xiàn)棕褐色，焦香風(fēng)味明顯，溫度低于92℃，美拉德反應(yīng)程度較低，產(chǎn)物特征香味不明顯；當(dāng)溫度高于95℃時(shí)，感官評(píng)分下降，可能是因?yàn)槊览路磻?yīng)程度較大，類(lèi)黑精物質(zhì)生成較多，掩蓋了原有的風(fēng)味[28-29]。同時(shí)，隨著溫度的升高，產(chǎn)品的黃藍(lán)值增大，美拉德反應(yīng)程度增大?？紤]經(jīng)濟(jì)成本和節(jié)約能源，因此選擇95℃為美拉德反應(yīng)溫度。

2.1.4 褐變時(shí)間的確定

反應(yīng)時(shí)間是影響美拉德反應(yīng)的重要因素之一，通常反應(yīng)時(shí)間與美拉德反應(yīng)程度成正比。由表4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，褐色益生菌羊乳飲料的感官評(píng)分呈現(xiàn)上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)褐變時(shí)間為150 min時(shí)，焦香風(fēng)味充足，但在褐變時(shí)間180 min時(shí)，產(chǎn)品伴有淡淡的苦香味。同時(shí)，產(chǎn)品的黃藍(lán)值隨著褐變時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，即美拉德反應(yīng)程度逐漸增大，當(dāng)褐變時(shí)間超過(guò)150 min時(shí)，產(chǎn)品基本呈現(xiàn)褐色?？紤]到經(jīng)濟(jì)成本和節(jié)約能源，因此選擇150 min為最佳褐變時(shí)間。

圖1 不同還原糖對(duì)褐色益生菌羊乳飲料品質(zhì)的影響

圖2 果糖添加量對(duì)褐色益生菌羊乳飲料品質(zhì)的影響

圖3 褐變溫度對(duì)褐色益生菌羊乳飲料品質(zhì)的影響

圖4 褐變時(shí)間對(duì)褐色益生菌羊乳飲料品質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以果糖添加量（A）、褐變溫度（B）、褐變時(shí)間（C）作為3因素，以黃藍(lán)值和感官評(píng)分為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示，對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3和表4。

利用Design-Expert軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，建立以黃藍(lán)值對(duì)果糖添加量（A）、褐變溫度（B）、褐變時(shí)間（C）的擬合方程為Y1=11.11+0.26A+1.37B+1.28C+0.015AB+-0.15BC-0.58A2+0.91B2+0.37C2。

由表4可知，當(dāng)模型F=311.00時(shí)，P＜0.0001，說(shuō)明模型是極顯著的。當(dāng)失擬項(xiàng)F=2.20時(shí)，P=0.2311＞0.05，說(shuō)明模型失擬項(xiàng)不顯著。決定系數(shù)R2=0.9975，校正系數(shù)R2Adj=0.9943，表明黃藍(lán)值的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，表明該模型能夠很好的對(duì)褐色益生菌羊乳飲料的黃藍(lán)值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

通過(guò)方差分析，該模型中的一次項(xiàng)A、B、C與二次項(xiàng)A2、B2、C2表現(xiàn)為極顯著，交互項(xiàng)BC表現(xiàn)為顯著，交互項(xiàng)AB、AC對(duì)黃藍(lán)值影響不顯著，表明實(shí)驗(yàn)中褐變溫度、褐變時(shí)間都對(duì)褐色益生菌羊乳飲料的黃藍(lán)值具有較大影響。由3個(gè)因素F值大小可以推斷影響褐色益生菌羊乳飲料品質(zhì)的各因素主次順序?yàn)椋築＞C＞A，即褐變溫度＞褐變時(shí)間＞果糖添加量。

利用Design-Expert軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，建立以感官評(píng)分對(duì)果糖添加量（A）、褐變溫度（B）、褐變時(shí)間（C）的擬合方程為Y1=77.60+0.75A+4.00B+3.25C+0.25AB+0.25AC+0.25BC-1.43A2+3.07B2-0.92C2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 黃藍(lán)值方差分析表

由表5可知，當(dāng)模型F=36.47時(shí)，P＜0.0001，說(shuō)明模型是極顯著的。當(dāng)失擬項(xiàng)F=1.04時(shí)，P=0.4649＞0.05，說(shuō)明模型失擬項(xiàng)不顯著。決定系數(shù)R2=0.9791，校正系數(shù)R2Adj=0.9943，表明感官評(píng)分的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，表明該模型能夠很好的對(duì)褐色益生菌羊乳飲料的感官評(píng)分進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

通過(guò)方差分析，該模型中的一次項(xiàng)B、C與二次項(xiàng)B2對(duì)感官評(píng)分影響極顯著，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)感官評(píng)分影響顯著，交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)感官評(píng)分影響不顯著，表明實(shí)驗(yàn)中褐變溫度、褐變時(shí)間都對(duì)褐色益生菌羊乳飲料的感官評(píng)分具有較大影響。由3個(gè)因素F值大小可以推斷影響褐色益生菌羊乳飲料品質(zhì)的各因素主次順序?yàn)椋築＞C＞A，即褐變溫度＞褐變時(shí)間＞果糖添加量。

表5 感官評(píng)分方差分析表

2.2.2 響應(yīng)面分析

為了考察各個(gè)交互項(xiàng)對(duì)褐色益生菌羊乳飲料黃藍(lán)值、感官評(píng)分的影響，利用Design-Expert軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行運(yùn)算，作出交互項(xiàng)的三維響應(yīng)面圖及等高線圖如圖5、圖6所示，能比較直觀的解釋各個(gè)變量和變量之間的對(duì)響應(yīng)值的影響。通過(guò)Design-Expert對(duì)建立的回歸方程進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，可得到黃藍(lán)值最高，感官評(píng)分最高時(shí)最佳褐變工藝條件，即果糖添加量11.35%、褐變溫度97℃、褐變時(shí)間180 min。在此條件下褐色益生菌羊乳飲料的黃藍(lán)值為14.3345，感官評(píng)分為86.352。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert軟件進(jìn)行回歸模型預(yù)測(cè)褐色益生菌羊乳飲料的最佳褐變工藝方案為果糖添加量11.35%、褐變溫度97℃、褐變時(shí)間180 min。為了檢驗(yàn)該回歸模型預(yù)測(cè)的可靠性，同時(shí)考慮到實(shí)際生產(chǎn)操作，將最佳褐變工藝方案更改為果糖添加量11%、褐變溫度97℃、褐變時(shí)間180 min。在該條件下重復(fù)三次試驗(yàn)，得到產(chǎn)品的平均黃藍(lán)值為14.12，平均感官評(píng)分為86.7，黃藍(lán)值的相對(duì)誤差為1.49%，感官評(píng)分的相對(duì)誤差為0.40%，與預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明該模型擬合度較好，能夠較好的預(yù)測(cè)實(shí)際情況。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法建立了多元回歸模型，確定了褐色益生菌羊乳飲料的最佳褐變工藝條件，即確定的最佳褐變工藝條件為：果糖添加量11%、褐變溫度97℃、褐變時(shí)間180 min。在此條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)中褐色益生菌羊乳飲料的平均黃藍(lán)值為14.12，平均感官評(píng)分為86.7，與預(yù)測(cè)值基本一致，此時(shí)美拉德反應(yīng)狀態(tài)良好，使褐色益生菌羊乳飲料色澤呈現(xiàn)黃褐色，焦糖風(fēng)味突出，口感細(xì)膩清爽，符合對(duì)生產(chǎn)飲料的要求，可以應(yīng)用到中試生產(chǎn)中。

圖5 各因素交互作用對(duì)黃藍(lán)值的響應(yīng)面和等高線圖

圖6 各因素交互作用對(duì)感官評(píng)分的響應(yīng)面和等高線圖