HPLC法測定防風(fēng)炭中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量

焦 坤

(阜陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，阜陽 236500)

防風(fēng)為常用中藥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，系傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根[1]，具有解表祛風(fēng)、勝濕、止痙的功能，用于治療感冒頭痛、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢及破傷風(fēng)等。防風(fēng)炭為防風(fēng)的加工炮制品，在臨床上應(yīng)用也較為廣泛。防風(fēng)炭常用于止血，多用于腸風(fēng)便血、崩中漏下等治療。常與大薊、地榆、蒲黃、黃柏、白茅根、仙鶴草、三七和側(cè)柏炭等配合使用。防風(fēng)的化學(xué)成分主要有色原酮類[2-3]、香豆素類[4-5]、揮發(fā)油[6-9]和多糖類[10-11]等。目前，針對防風(fēng)的質(zhì)量控制研究[12-16]較多。根據(jù)前人的研究，防風(fēng)中的色原酮是其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)[17-19]。胡紫艷等[20]對不同產(chǎn)地的防風(fēng)以5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚、苷升麻素和升麻素苷4種色原酮為指標(biāo)進(jìn)行了含量分析。邵留英等[21]對不同產(chǎn)地的防風(fēng)中升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量進(jìn)行了對比分析。趙博等[22]用HPLC法同時(shí)測定了防風(fēng)中6個(gè)主要成分的含量?！吨袊幍洹?015 年版一部防風(fēng)項(xiàng)下以升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷為質(zhì)控指標(biāo)，其炮制品種防風(fēng)炭暫未收錄。目前關(guān)于防風(fēng)炭含量測定方面研究較少，如何做到“炒炭存性”，尚缺乏有效的質(zhì)量控制指標(biāo)。本文通過建立合理高效的HPLC法同時(shí)測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷，進(jìn)一步加強(qiáng)對防風(fēng)炭的質(zhì)量控制，提高療效。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Thermo UIti Mate 3 000 型高效液相色譜儀 (美國賽默飛世爾科技公司，包括 DAD3000 型檢測器、變色龍 7.2 軟件工作站)；XPE205DR 型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司) ； E100H 型超聲清洗儀 (德國艾爾瑪儀器公司)。

1.2試藥 升麻素苷(prim-O-glucosylcimifugin)對照品(批號111522-201310，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.0%)，5-O-甲基維斯阿米醇苷(5-O-methylvisammioside)對照品(批號111523-201509，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.8%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；10批不同產(chǎn)地的防風(fēng)炭(安徽省萬生中藥飲片廠，編號分別為：FFC01，F(xiàn)FC02，F(xiàn)FC03，F(xiàn)FC04，F(xiàn)FC05，F(xiàn)FC06，F(xiàn)FC07，F(xiàn)FC08，F(xiàn)FC09和FFC10)。HPLC所用的甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。水為純化水，自制。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Rigol-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇∶水(40∶60)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm；在此色譜條件下，樣品中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的分離度大于1.5。理論塔板數(shù)按照升麻素苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。結(jié)果見圖1。

圖1HPLC圖

A.混合對照品；B.供試品溶液；1.升麻素苷；2.5-O-甲基維斯阿米醇苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A．mixed reference substance；B.sample；1.prim-O-glucosylcimifugin；2.5-O-methylvisammioside.

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品儲備液 分別精密稱取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.292 4和0.284 5 mg·mL-1的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對照品溶液，作為儲備液。

2.2.2供試品溶液 取本品細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3線性關(guān)系 精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的儲備液各1.0，2.0，2.5，5.0和10.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，加儲備液，得到6個(gè)不同系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積值為縱坐標(biāo)(y)，得到升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：(升麻素苷：y=119.706 4x+0.038 29，r=0.999 4；5-O-甲基維斯阿米醇苷：y=135.704 5x+0.083 54，r=0.999 4)。結(jié)果表明，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的進(jìn)樣量分別在0.011 6～0.292和0.011 4～0.285 mg·mL-1范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.4精密度實(shí)驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下稀釋得到的系列對照品溶液(2.5→25)，按照2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次5 μL，記錄峰面積。升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的峰面積的RSD值分別為1.309%和1.347%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取編號為FFC10的防風(fēng)炭0.5 g，按照2.2.2項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，然后按照2.1項(xiàng)色譜條件測定峰面積值，分別求得升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均含量分別為0.302%和0.190%，其RSD值分別為0.74%和1.95%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下的同一供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0，2，4，8，12和24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的峰面積的RSD值分別為1.11%和1.32%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一已知升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的供試品溶液6份，分別加入儲備液各1.0 mL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得到升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均回收率分別為93.14%和95.09%，結(jié)果表明，該方法的回收率良好。見表1。

表1加樣回收率測定結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test

化學(xué)成分實(shí)測值/mg樣品含量/mg加入量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%升麻素苷0.546 00.280 80.292 490.7293.142.510.562 20.280 90.292 496.230.560 80.284 60.292 494.460.547 70.281 80.292 490.940.561 00.283 60.292 494.890.549 30.281 30.292 491.645-O-甲基維斯阿米醇苷0.549 20.282 80.284 593.6395.092.260.558 60.282 90.284 596.880.560 00.286 60.284 596.090.544 50.283 80.284 591.630.562 40.285 60.284 597.300.553 70.283 40.284 595.01

2.8樣品測定 取10批不同產(chǎn)地的防風(fēng)炭樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得10批防風(fēng)炭中升麻素苷的含量分別為0.180%，0.111%，0.211%，0.307%，0.160%，0.108%，0.167%，0.261%，0.273%和0.302%；5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量分別為0.082%，0.112%，0.364%，0.220%，0.208%，0.165%，0.099%，0.181%，0.179%和0.190%。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的防風(fēng)炭所含的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷差異較大，可能與產(chǎn)地、采收時(shí)期和炒炭程度等因素有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3 討論

3.1測定波長的選擇 參照《中國藥典》2015年版一部防風(fēng)項(xiàng)下的方法，選取254 nm作為檢測波長，發(fā)現(xiàn)升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇色譜峰信號強(qiáng)，峰形較好，符合測定要求。

3.2流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別比較了甲醇-水，甲醇-磷酸-水和乙腈-甲醇-水[23]等系統(tǒng)，結(jié)果表明，甲醇-水作為流動(dòng)相，基線較為平穩(wěn)，且對色譜柱損傷小，最終采用甲醇-水作為本實(shí)驗(yàn)方法的流動(dòng)相。

3.3提取溶劑的選擇 本文比較了甲醇、乙醇和體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇提取溶劑，結(jié)果顯示，甲醇的提取率高于乙醇和體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇。同時(shí)參考文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)甲醇對色原酮的提取率高[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑。

3.4方法的適用性 本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC法測定防風(fēng)炭中的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量方法，具有快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可有效評價(jià)防風(fēng)炭的質(zhì)量，為含有防風(fēng)炭的成方制劑的質(zhì)量控制提供了參考。