• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于脊髓 NLRP1-Caspase-1-IL-1β通路探討電針治療神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制*

    2018-09-20 06:21:00王志福楊意州劉建波李長征龔德貴俞向梅
    中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志 2018年9期
    關(guān)鍵詞:背角鞘內(nèi)神經(jīng)病

    王志福 楊意州 劉建波 李長征 龔德貴 俞向梅△

    (1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州350122;2福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院,福州350003)

    神經(jīng)病理性疼痛常見于各種疾患中,治療遷延反復(fù)。各種藥物的治療,仍存在一定的不良反應(yīng),電針治療神經(jīng)病理性疼痛具有安全、簡便而無副作用的優(yōu)點(diǎn),臨床及基礎(chǔ)研究已證實電針鎮(zhèn)痛的有效性,而其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究[1,2]。白介素-1β(Interleukin-1 beta, IL-1β) 作為重要的促炎細(xì)胞因子之一,在神經(jīng)性病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起重要作用[3]。

    核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 (nod-like receptor proteins, NLRP) 炎性體,是一類由NLRP蛋白家族成員、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)和 接 頭 蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing caspase-activating recruitment domain, ASC) 組成的蛋白復(fù)合物,已知其主要功能是參與IL-1β的成熟過程[4,5]。NLRP1是人類NLRP家族中最早發(fā)現(xiàn)的一個成員,基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn),NLRP1可識別和感知體內(nèi)外各種傷害性信號,與各種疼痛(如復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、佐劑關(guān)節(jié)炎、慢性盆腔疼痛綜合征等)發(fā)生密切相關(guān),表現(xiàn)為外周組織及脊髓內(nèi)NLRP1、caspase-1、IL-1β等活化增加。炎癥小體中,NLRP1及其產(chǎn)物caspase-1是IL-1β成熟的重要上游通路,激活的NLRP1參與疼痛敏化的形成過程[6~9]。外周神經(jīng)損傷時,脊髓IL-1β 轉(zhuǎn)錄表達(dá)大量IL-1β前體分子,被重要蛋白酶caspase-1剪切為成熟IL-1β,從而發(fā)揮生物學(xué)活性[10]。

    本項目組前期實驗研究證實,在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生時,脊髓內(nèi)大量IL-1β成熟釋放,與NLRP1及caspase-1活化密切相關(guān);電針環(huán)跳、陽陵泉對神經(jīng)病理性疼痛具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用,可減少脊髓內(nèi)IL-1β的產(chǎn)生[6,11,12]。而電針是否可通過調(diào)節(jié)脊髓NLRP1及caspase-1活性,從而降低脊髓IL-1β釋放,以發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用,是本研究關(guān)注的主要問題。

    方 法

    1.實驗動物

    SPF 級雄性 Sprague-Dawley大鼠42只,體重200~220 g,由上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司提供,生產(chǎn)許可證號 SCXK(滬)2012-0002。在福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,許可證號SYXK(閩)2013-009。將大鼠稱重并編號。所有實驗均遵照國際動物保護(hù)和使用指南的規(guī)定實施。

    2.試劑與儀器

    使用4-0鉻制羊腸線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司)。華佗牌一次性針灸針 (0.28 mm×15 mm)、電針治療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。Belnacasan,VX-765 (貨號:S2228,50 mg粉末裝),美國Selleck生物科技有限公司;胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide,MDP,貨號:A9519,規(guī)格:5 mg), 美 國 Sigma公 司。NLRP1、Caspase-1,GAPDH引物,生工生物工程(上海)股份有限公司合成。IQ5多重實時熒光定量 PCR儀器,美國Bio-Rad公司。38450 -電子觸覺測量儀(電子Von Frey),意大利Ugo Basile公司;輻射熱測痛儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)。

    3.實驗分組及模型制備

    采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組(CCI)、假手術(shù)組(Sham-operation)、電針組(Electro-acupuncture, EA)、非電針組 (Sham-EA)、DMSO組、VX-765(Caspase1抑制劑)組、MDP (NLRP1激活劑)組,每組各6只。模型組建立坐骨神經(jīng)慢性限制性損傷 (chronic constriction injury, CCI) 神經(jīng)病理性疼痛模型,不干預(yù);假手術(shù)組只切開皮膚,不結(jié)扎坐骨神經(jīng);電針組造模成功第7天后(P7),選取“環(huán)跳”、“陽陵泉”穴電針,每日1次,持續(xù)干預(yù)至P14;非電針組大鼠只進(jìn)行針刺如上穴位,不接通電針治療儀;DMSO組造模成功第7天后(P7),脊髓鞘內(nèi)注射8% DMSO 3次,每次注射20 μl;VX-765(Caspase-1抑制劑)組分別在P7、P10、P14脊髓鞘內(nèi)注射VX-765(溶解于8% DMSO,2 mg/kg注射)各1次;MDP組分別在P7、P10、P14脊髓鞘內(nèi)注射MDP(溶解于8%DMSO,0.1 mg/kg注射)各1次。坐骨神經(jīng)慢性限制性損傷 (chronic constriction injury,CCI)神經(jīng)病理性疼痛模型制備過程如下:大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉 (4 ml/kg) 后,右側(cè)后肢皮膚切開,肌肉鈍性分離,暴露坐骨神經(jīng),在坐骨神經(jīng)中段用4-0鉻制羊腸線松扎四道,致慢性CCI神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型,術(shù)后在傷口處撒適量青霉素粉末預(yù)防感染。模型建立后,術(shù)后第7日 (P7)和第14日 (P14) 觀察實驗大鼠機(jī)械痛、熱痛行為學(xué)變化。

    4.電針干預(yù)方法

    電針穴位參照大鼠穴位圖譜(華興邦, 周浩良.大鼠穴位圖譜的研制.實驗動物與動物實驗,1991),結(jié)合本課題以往研究經(jīng)驗[12],擬取手術(shù)患側(cè) (右側(cè)) 肢體的“環(huán)跳”(GB30) 與“陽陵泉”(GB34)穴,給予“疏密波”(2 Hz/100 Hz 交替;強(qiáng)度≤1 mA;時間 30 min)電針治療。安靜環(huán)境中,室溫20±2℃,將大鼠軀干固定于木架上,頭部與四肢可自由活動,靜置 20 min后,將 0.25寸一次性針灸針刺入大鼠右側(cè)“環(huán)跳”與“陽陵泉”穴,通過G6805-1A型多功能電針治療儀給予“疏密波”刺激,強(qiáng)度以引起大鼠后肢肌肉輕微抖動而不嘶叫為宜 (≤ 1 mA)。

    5.脊髓鞘內(nèi)注射方法

    大鼠取俯臥位,實驗者食指定位于大鼠脊柱L5-6間隙,右手持微量注射器從間隙垂直緩慢進(jìn)針,以大鼠尾巴出現(xiàn)顫動或突然的側(cè)向甩動作為穿刺成功的標(biāo)志,注入相應(yīng)的工具藥 (VX-765、MDP) 或等劑量 DMSO 緩沖液 20 μl。

    6.觀測指標(biāo)

    (1)機(jī)械痛行為測試

    測試環(huán)境為10 cm × 20 cm × 20 cm有機(jī)玻璃籠,將大鼠放入籠內(nèi)靜置10 min后,采用Ugo Basile原創(chuàng)設(shè)計的電子觸覺測量儀(e-VF),自動記錄大鼠的受刺激強(qiáng)度(即大鼠的縮爪反應(yīng)閾值),以此反應(yīng)大鼠的機(jī)械痛敏情況。

    (2)熱痛行為測試

    安靜環(huán)境中,室溫 20±2℃,將大鼠放入測痛儀上方的玻璃格子中,自由活動。大鼠靜置20 min后,采用336型輻射熱測痛儀強(qiáng)光照射大鼠足掌,測定大鼠的縮爪潛伏期 (paw withdrawal latency, PWL)。測定時每次間隔不低于l min,大鼠 PWL 基本穩(wěn)定后取后3次測定結(jié)果的平均值作為基礎(chǔ)值 (baseline)。測定時熱源強(qiáng)度維持在恒定水平,使基礎(chǔ)痛閾控制在8~12 s左右。為防止大鼠熱輻射燙傷,將PWL的上限值 (cut-off time) 定為20 s。

    (3)脊髓IL-1β、NLRP1、Caspase-1檢測

    全部實驗結(jié)束后 (P14),迅速新鮮取材脊髓 (L4-5節(jié)段)背角置于液氮中,最后儲存于-80℃保存待測。ELISA法檢測脊髓成熟蛋白IL-1β表達(dá)變化,real time-PCR檢測脊髓NLRP1、caspase-1 mRNA表達(dá)變化。

    7.統(tǒng)計學(xué)分析

    采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 ()表示。實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布,采用秩和檢驗中獨(dú)立樣本比較。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1.神經(jīng)病理性疼痛大鼠機(jī)械痛、熱痛行為學(xué)變化

    與假手術(shù)組相比,模型組 (CCI) 大鼠從造模后第7天、第14天,機(jī)械痛、熱痛閾值均顯著降低 (P< 0.01);與模型組相比,多次電針可顯著提高CCI大鼠機(jī)械痛、熱痛閾值 (P< 0.01),非電針并未改變痛行為學(xué)變化(見圖1A, 1B)。

    與模型組相比,多次脊髓鞘內(nèi)注射VX-765則可明顯提高大鼠機(jī)械痛、熱痛閾值(P< 0.01),而多次脊髓鞘內(nèi)注射MDP卻可進(jìn)一步降低大鼠機(jī)械痛、熱痛閾值 (P< 0.01、P< 0.05,見圖 2A, 2B)。

    2.神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓NLRP1、Caspase-1mRNA表達(dá)變化的影響

    在造模后第14天,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA表達(dá)顯著增加(P< 0.01);與模型組相比,多次電針可顯著降低脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA的表達(dá) (P< 0.01),鞘內(nèi)注射caspase-1抑制劑 (VX-765)可顯著抑制脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA的表達(dá) (P< 0.01);相反,鞘內(nèi)注射NLRP1激活劑 (MDP)則進(jìn)一步上調(diào)脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA的表達(dá) (P< 0.01,見圖 3A, 3B)。

    3.神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓IL-1β表達(dá)變化的影響

    在造模后第14天,脊髓ELISA檢測方法結(jié)果提示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脊髓背角成熟蛋白IL-1β的表達(dá)顯著增加 (P< 0.01);與模型組相比,多次電針可顯著降低脊髓背角IL-1β蛋白的表達(dá) (P< 0.01),脊髓鞘內(nèi)注射caspase-1抑制劑 (VX-765)可顯著抑制脊髓成熟蛋白IL-1β的表達(dá) (P<0.01);相反,鞘內(nèi)注射NLRP1激活劑 (MDP) 則進(jìn)一步上調(diào)脊髓IL-1β的表達(dá) (P< 0.01,見圖4)。

    討 論

    神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損害或疾病導(dǎo)致的疼痛;神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生時,脊髓中樞內(nèi)出現(xiàn)顯著的神經(jīng)炎癥,抑制脊髓中樞炎癥可減輕痛敏反應(yīng)[13,14]。經(jīng)典CCI神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型,在一定程度上模擬臨床干性坐骨神經(jīng)病理性疼痛特點(diǎn)。本課題組前期研究證實,電針“環(huán)跳”、“陽陵泉”穴對神經(jīng)病理性疼痛大鼠具有顯著鎮(zhèn)痛作用[12,15],臨床應(yīng)用二穴電針治療坐骨神經(jīng)病理性疼痛,療效明確,其脊髓中樞機(jī)制有待進(jìn)一步明確[16,17]。

    圖1 電針對神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛、熱痛行為變化的影響(n = 6,EM)Fig.1 Changes of the paw withdrawal threshold and paw withdrawal latency with Electroacupuncture intervention (n = 6,EM)

    圖2 NLRP1Caspase-1對神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛、熱痛行為變化的影響(n = 6,EM)Fig.2 Changes of the paw withdrawal threshold and paw withdrawal latency with NLRP1Caspase-1 pathway regulation (n = 6,EM)

    圖3 電針對神經(jīng)痛大鼠脊髓NLRP1、Caspase-1mRNA表達(dá)變化的影響(n = 4,EM)Fig.3 Changes of the spinal expression of NLRP1 and Caspase-1 mRNA with Electroacupuncture intervention(n = 4,EM)

    圖4 電針對神經(jīng)痛大鼠脊髓IL-1β表達(dá)變化的影響(n = 4,EM)Fig.4 Changes of the spinal expression of IL-1β protein with Electroacupuncture intervention (n = 4,EM)

    坐骨神經(jīng)病理性疼痛屬中醫(yī)學(xué)痹癥的范疇,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析,環(huán)跳、陽陵泉穴深層解剖 為坐骨神經(jīng)及其分支;針刺刺激穴位鄰近神經(jīng)及其周圍血管,可促進(jìn)局部血液循環(huán),改善局部炎癥和滲出,緩解神經(jīng)病理性疼痛癥狀[18]。

    本課題組前期研究表明,在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生及發(fā)展中,脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化可釋放促炎癥因子(IL-1β、IL-6等),維持脊髓中樞敏化和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。在神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中,NLRP-l炎癥小體被顯著激活,激活的NLRP-l及caspase-1主要表達(dá)于脊髓背角淺層星形膠質(zhì)細(xì)胞中[6,11,19]。當(dāng)受到外來刺激時,激活的炎癥小體NLRP-l可水解其組成結(jié)構(gòu)中的pro-caspase-1分子使其成為成熟caspase-1,成熟caspase-1大量釋放并剪切IL-1β前體分子變成為成熟IL-1β,參與炎癥反應(yīng)過程[20]。結(jié)合既往文獻(xiàn)報道及前期研究,本實驗說明,神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中,脊髓內(nèi)炎癥小體NLRP-l和caspase-1激活,促進(jìn)脊髓IL-1β成熟釋放,維持中樞敏化和神經(jīng)炎癥,表現(xiàn)機(jī)械痛和熱痛過敏反應(yīng)。應(yīng)用電針或caspase-1抑制劑可降低脊髓IL-1β表達(dá)水平,提高神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛閾值,從而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用;然而,經(jīng)典NLRP-l激活物(胞壁酰二肽,MDP)鞘內(nèi)注射可顯著激活NLRP-l-caspase-1-IL-1β信號通路,促進(jìn)脊髓IL-1β釋放增多,進(jìn)一步誘發(fā)痛敏反應(yīng)。

    綜上所述,神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展與脊髓背角NLRP-l-caspase-1-IL-1β信號通路活化存在密切的聯(lián)系,電針抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能與抑制脊髓NLRP-l-caspase-1-IL-1β通路活化有關(guān),今后可應(yīng)用NLRP-l、IL-1β、Caspase-1等基因敲除小鼠深入開展實驗,進(jìn)一步明確電針抗炎鎮(zhèn)痛的脊髓中樞IL-β調(diào)節(jié)機(jī)制。

    猜你喜歡
    背角鞘內(nèi)神經(jīng)病
    HCN通道對大鼠脊髓背角神經(jīng)元P2X受體功能的調(diào)節(jié)作用
    不同劑量兩性霉素B鞘內(nèi)注射聯(lián)合腦脊液持續(xù)引流置換治療新型隱球菌性腦膜炎的對比
    糖尿病人應(yīng)重視神經(jīng)病變
    獨(dú)一味對糖尿病痛大鼠脊髓背角內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:20
    越測越開心
    鞘內(nèi)連續(xù)注射嗎啡和地塞米松在癌性骨痛中的療效及其機(jī)制
    多發(fā)性硬化應(yīng)用β干擾素鞘內(nèi)注射治療的效果分析
    脊髓背角MCP-1-JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與大鼠2型糖尿病神經(jīng)病理性痛的機(jī)制研究
    慎玩,當(dāng)心成神經(jīng)??!
    汽車生活(2015年6期)2015-05-30 04:59:21
    腦脊液置換聯(lián)合鞘內(nèi)給藥治療結(jié)核性腦膜炎的臨床效果
    制服人妻中文乱码| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产69精品久久久久777片 | 精品久久久久久成人av| 午夜激情欧美在线| 美女高潮的动态| 黄频高清免费视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久99热这里只有精品18| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久久久国内视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 啦啦啦免费观看视频1| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 黄色日韩在线| 9191精品国产免费久久| 午夜久久久久精精品| 国产视频内射| 成年人黄色毛片网站| a在线观看视频网站| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 久久久久久久精品吃奶| 久久精品综合一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 久久亚洲精品不卡| 欧美日本亚洲视频在线播放| av中文乱码字幕在线| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美日本视频| 99国产精品99久久久久| 亚洲av成人一区二区三| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产97色在线日韩免费| 国产精华一区二区三区| 黄频高清免费视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲九九香蕉| 一二三四社区在线视频社区8| 精品日产1卡2卡| 亚洲成人久久爱视频| 国产成人aa在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 可以在线观看的亚洲视频| 日韩av在线大香蕉| 久久亚洲真实| 欧美黑人巨大hd| 日本精品一区二区三区蜜桃| 美女午夜性视频免费| 在线观看午夜福利视频| 九九热线精品视视频播放| 久久天堂一区二区三区四区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一级a爱片免费观看的视频| 国产高清激情床上av| 婷婷亚洲欧美| 手机成人av网站| 日本一本二区三区精品| 怎么达到女性高潮| 欧美日本视频| 免费av不卡在线播放| 麻豆成人av在线观看| 国产一区二区三区视频了| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 9191精品国产免费久久| 一级毛片精品| 欧美最黄视频在线播放免费| 1024手机看黄色片| av在线天堂中文字幕| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久精品人妻少妇| 老汉色∧v一级毛片| 国产亚洲av高清不卡| 757午夜福利合集在线观看| 成人精品一区二区免费| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久这里只有精品19| 真人一进一出gif抽搐免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| www.自偷自拍.com| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产成人av激情在线播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产1区2区3区精品| 久久精品国产综合久久久| 无限看片的www在线观看| 91字幕亚洲| 波多野结衣高清无吗| 午夜免费成人在线视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产高清激情床上av| or卡值多少钱| 久久久久久久精品吃奶| 91久久精品国产一区二区成人 | 18禁观看日本| 午夜福利欧美成人| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产av在哪里看| 男人舔奶头视频| 国产高潮美女av| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲性夜色夜夜综合| 国产三级黄色录像| 99精品欧美一区二区三区四区| 1024香蕉在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| av国产免费在线观看| 丁香欧美五月| 久久精品影院6| 日本精品一区二区三区蜜桃| 香蕉av资源在线| 深夜精品福利| 叶爱在线成人免费视频播放| 日本 欧美在线| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久久国产成人精品二区| 观看免费一级毛片| 麻豆国产av国片精品| 三级毛片av免费| 免费看日本二区| 日日夜夜操网爽| 特级一级黄色大片| 白带黄色成豆腐渣| 不卡一级毛片| 村上凉子中文字幕在线| 久久99热这里只有精品18| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人特级av手机在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲欧美日韩高清专用| 午夜精品在线福利| 精品无人区乱码1区二区| 色av中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av成人一区二区三| 国产成人福利小说| 午夜福利18| 国产爱豆传媒在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 村上凉子中文字幕在线| 久久人人精品亚洲av| 国产成人系列免费观看| www日本黄色视频网| av国产免费在线观看| 最新中文字幕久久久久 | 97超视频在线观看视频| 亚洲av免费在线观看| 久久久久久久久久黄片| 亚洲精品色激情综合| 国产黄a三级三级三级人| 麻豆国产97在线/欧美| 99国产综合亚洲精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美激情在线99| 亚洲五月天丁香| 成人无遮挡网站| tocl精华| 黄色丝袜av网址大全| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲午夜理论影院| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美日本视频| 免费av不卡在线播放| 美女免费视频网站| 热99在线观看视频| 亚洲18禁久久av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 视频区欧美日本亚洲| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产黄色小视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 高清毛片免费观看视频网站| 美女cb高潮喷水在线观看 | 国产97色在线日韩免费| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久久久久久久中文| 国产精品亚洲美女久久久| 日本成人三级电影网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久国产欧美日韩av| 久久亚洲精品不卡| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产一区二区在线av高清观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 一个人免费在线观看的高清视频| 黄频高清免费视频| 久久久久国内视频| bbb黄色大片| 人妻久久中文字幕网| 成人欧美大片| 岛国在线观看网站| 波多野结衣高清无吗| 99久久精品热视频| 午夜福利免费观看在线| 日韩av在线大香蕉| 国产美女午夜福利| 99久久精品一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 亚洲成人久久爱视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 看片在线看免费视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产伦人伦偷精品视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 成人国产一区最新在线观看| 99久久精品热视频| 国产精品精品国产色婷婷| www.www免费av| 欧美3d第一页| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 曰老女人黄片| 不卡一级毛片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产私拍福利视频在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 成人av在线播放网站| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 一本综合久久免费| 国产高潮美女av| 精品乱码久久久久久99久播| 免费搜索国产男女视频| 国产精品久久电影中文字幕| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 黄色日韩在线| 一级a爱片免费观看的视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 好男人在线观看高清免费视频| svipshipincom国产片| 国产精品亚洲美女久久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 一级作爱视频免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 色综合婷婷激情| 日韩欧美精品v在线| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲中文av在线| 天天躁日日操中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 在线观看免费视频日本深夜| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美成狂野欧美在线观看| 观看免费一级毛片| 日本成人三级电影网站| 色综合婷婷激情| 免费av不卡在线播放| 久久久久久久久久黄片| 亚洲五月婷婷丁香| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲国产欧美一区二区综合| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品野战在线观看| 欧美日韩黄片免| 十八禁网站免费在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲国产精品合色在线| av欧美777| 母亲3免费完整高清在线观看| 高清在线国产一区| 在线观看免费视频日本深夜| 国产欧美日韩一区二区三| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99riav亚洲国产免费| 女人被狂操c到高潮| 国产伦精品一区二区三区四那| 在线观看66精品国产| www日本黄色视频网| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲五月婷婷丁香| xxx96com| 一个人看的www免费观看视频| xxxwww97欧美| 国产精品永久免费网站| 搞女人的毛片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产午夜精品久久久久久| a级毛片在线看网站| 日本在线视频免费播放| 国产毛片a区久久久久| 午夜视频精品福利| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产伦人伦偷精品视频| 国产69精品久久久久777片 | 色在线成人网| 国产成人福利小说| 亚洲成av人片免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲无线观看免费| 午夜两性在线视频| 亚洲五月天丁香| 精品国产美女av久久久久小说| 动漫黄色视频在线观看| 日本与韩国留学比较| 国产午夜精品久久久久久| 激情在线观看视频在线高清| 男人舔女人的私密视频| 亚洲精品色激情综合| 亚洲黑人精品在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产伦精品一区二区三区四那| 999精品在线视频| 九色成人免费人妻av| 国产精品 国内视频| 又爽又黄无遮挡网站| 丁香六月欧美| 日本成人三级电影网站| 在线永久观看黄色视频| 国产一区二区激情短视频| 在线永久观看黄色视频| 草草在线视频免费看| 精品熟女少妇八av免费久了| 日日夜夜操网爽| 日本成人三级电影网站| 久久久国产欧美日韩av| 舔av片在线| 精品无人区乱码1区二区| 欧美乱色亚洲激情| 婷婷精品国产亚洲av在线| 淫秽高清视频在线观看| 后天国语完整版免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 好男人电影高清在线观看| 久久精品影院6| 在线播放国产精品三级| 中亚洲国语对白在线视频| 午夜激情福利司机影院| 好男人电影高清在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美3d第一页| 99国产精品一区二区三区| 最好的美女福利视频网| 国产精品av久久久久免费| 免费看日本二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日日干狠狠操夜夜爽| 午夜免费观看网址| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 日本三级黄在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| АⅤ资源中文在线天堂| 很黄的视频免费| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 最新在线观看一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 亚洲中文av在线| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲av电影在线进入| www.精华液| 一进一出抽搐gif免费好疼| 一夜夜www| 91老司机精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲激情在线av| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 午夜两性在线视频| 听说在线观看完整版免费高清| 伦理电影免费视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成人一区二区视频在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 最近在线观看免费完整版| 天天一区二区日本电影三级| 男女床上黄色一级片免费看| 国产单亲对白刺激| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久伊人香网站| 91字幕亚洲| 色精品久久人妻99蜜桃| 人人妻人人看人人澡| 18禁美女被吸乳视频| 狂野欧美激情性xxxx| 成人特级黄色片久久久久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲人成网站高清观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 国产免费男女视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品久久久久久久电影 | 国产三级在线视频| 国产成人精品久久二区二区91| 国产成人av激情在线播放| 亚洲成人中文字幕在线播放| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产午夜精品久久久久久| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 最近最新中文字幕大全电影3| 日本与韩国留学比较| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 久久久久久国产a免费观看| 国产av一区在线观看免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 毛片女人毛片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲精品一区av在线观看| 久久性视频一级片| 日本 av在线| 午夜激情欧美在线| 精品国产亚洲在线| 69av精品久久久久久| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 身体一侧抽搐| 免费人成视频x8x8入口观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产久久久一区二区三区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 在线观看免费午夜福利视频| 久久香蕉精品热| 亚洲国产欧美人成| 最新美女视频免费是黄的| 91麻豆精品激情在线观看国产| 十八禁人妻一区二区| 亚洲国产欧美网| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲最大成人中文| 十八禁网站免费在线| 狂野欧美激情性xxxx| 日本黄大片高清| 日日干狠狠操夜夜爽| 脱女人内裤的视频| 在线观看一区二区三区| 可以在线观看的亚洲视频| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩欧美在线二视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 色综合婷婷激情| 国产精品一及| 欧美丝袜亚洲另类 | 桃红色精品国产亚洲av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产91精品成人一区二区三区| 色视频www国产| 全区人妻精品视频| 免费看美女性在线毛片视频| 99热这里只有是精品50| 91av网一区二区| 久99久视频精品免费| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品av久久久久免费| 亚洲在线观看片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 精品无人区乱码1区二区| 熟女电影av网| 成人午夜高清在线视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 美女黄网站色视频| 人妻久久中文字幕网| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 十八禁人妻一区二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久香蕉国产精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 搡老岳熟女国产| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲电影在线观看av| 欧美在线一区亚洲| 欧美日本视频| 天堂动漫精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久久国产欧美日韩av| 色综合婷婷激情| 亚洲片人在线观看| 国产97色在线日韩免费| ponron亚洲| 国产精华一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久免费精品人妻一区二区| 成人特级av手机在线观看| 国产综合懂色| 亚洲片人在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲欧美日韩高清专用| 九九在线视频观看精品| 亚洲国产精品成人综合色| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久久久大精品| 91老司机精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 18禁黄网站禁片免费观看直播| aaaaa片日本免费| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 99国产极品粉嫩在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 国产极品精品免费视频能看的| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产毛片a区久久久久| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲成av人片在线播放无| 色综合站精品国产| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产欧美日韩精品亚洲av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品一及| 久久久精品大字幕| 国产成年人精品一区二区| 怎么达到女性高潮| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美大码av| 哪里可以看免费的av片| 少妇的逼水好多| 一个人免费在线观看电影 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 高清在线国产一区| 最新中文字幕久久久久 | 国产亚洲精品一区二区www| av黄色大香蕉| 精品国产三级普通话版| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 香蕉国产在线看| 亚洲熟女毛片儿| 一边摸一边抽搐一进一小说| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 韩国av一区二区三区四区| 九九热线精品视视频播放| 国产1区2区3区精品| 日韩三级视频一区二区三区| 男女那种视频在线观看| 亚洲18禁久久av| 免费在线观看日本一区| 亚洲av美国av| 美女大奶头视频| 99久久精品国产亚洲精品| 91字幕亚洲| 亚洲成人久久爱视频| 悠悠久久av| 最近在线观看免费完整版| 国产午夜福利久久久久久| a在线观看视频网站| 在线观看免费视频日本深夜| 青草久久国产| 日本免费一区二区三区高清不卡| 桃色一区二区三区在线观看| 国产av在哪里看| 成人亚洲精品av一区二区| 久久中文看片网| 看片在线看免费视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲专区国产一区二区| 桃红色精品国产亚洲av| 麻豆成人av在线观看| 在线观看午夜福利视频| 久久国产精品影院| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 色播亚洲综合网| 国产黄片美女视频| 夜夜爽天天搞| 黄色成人免费大全| 麻豆av在线久日| 国产黄片美女视频| 国产精品 国内视频| 在线观看66精品国产| 免费看十八禁软件| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日本 欧美在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 成人无遮挡网站| 成年女人看的毛片在线观看|