柴胡皂苷對癲癇大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)谷氨酸、γ-羥基丁酸含量的影響

癲癇是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以部分性、突發(fā)性、暫時性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常所致反復(fù)驚厥發(fā)作的慢性腦部疾病[1]，病人以口吐白沫、四肢抽動、神智喪失等為主要臨床表現(xiàn)。最新調(diào)查研究表明，癲癇的臨床總體患病率超過0.70%，每年發(fā)作活動性癲癇患病率約0.46%[2]。最新調(diào)查研究表明，癲癇病人超過900萬人，活動性癲癇病人為350萬人～600萬人，每年新增癲癇病人約40萬[3]，已成為神經(jīng)內(nèi)科僅次于頭痛患病人數(shù)的第二大常見病。一般認(rèn)為癲癇的發(fā)生和興奮性氨基酸水平升高及抑制性氨基酸水平降低有關(guān)[4]。谷氨酸和γ-羥基丁酸是腦內(nèi)的一對興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為癲癇的發(fā)生與頭顱神經(jīng)受損相關(guān)，病人出現(xiàn)臟腑功能失調(diào)，歷代醫(yī)家大多認(rèn)為本病重視從痰論治，《古今醫(yī)鑒》提及“夫癰者有五等”“皆是痰迷心竅”“治之不需分五，俱宜豁痰順氣，清火平肝”。中醫(yī)藥治療癲癇取得一定進(jìn)展，有研究表明中藥柴胡具有中樞抑制作用，可抗癲癇，并進(jìn)一步論證其有效成分為柴胡皂苷，其具有抑制Na+-K+-ATP酶活性的作用[6]。本研究利用癲癇模型大鼠，探討柴胡皂苷對癲癇大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)谷氨酸、γ-羥基丁酸含量的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 柴胡皂苷，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；氯化鋰，北京鼎豐基業(yè)生物科技發(fā)展有限公司；鹽酸匹羅卡品，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；硫酸阿托品注射液，黑龍江瑞格制藥有限公司；丙戊酸鈉片劑，上海永葉生物科技有限公司；注射用異戊巴比妥鈉，上海新亞藥業(yè)有限公司；10%甲醛溶液、水合氯醛、蘇木素及伊紅染料均由西安潤堡生物科技有限公司提供；兔抗谷氨酸抗體，上海江萊生物科技有限公司；兔抗γ-氨基丁酸抗體，北京百奧萊博科技有限公司；二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑、磷酸鹽緩沖液及枸櫞酸鈉緩沖液體，北京索萊寶科技有限公司。

Rotat-Count-8旋轉(zhuǎn)監(jiān)視系統(tǒng)，上海玉研科學(xué)儀器有限公司；泰盟醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)BI-2000，成都泰盟軟件有限公司；FA2004電子分析天平，上海巴玖實業(yè)有限公司；DK-S600電熱恒溫水槽，上海豫明儀器有限公司；德國WItec Alpha300-SNOM近場光學(xué)顯微鏡，上海巨納科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗大鼠的選擇和喂養(yǎng) 選擇健康Spague-Dawley(SD)大鼠SPF級，體重220 g±30 g，大鼠由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，貨號：J009，醫(yī)動字第18-2037號。動物許可證號：SYXK(京)2016-0304。分籠飼養(yǎng)，大鼠使用的籠具、飼料及墊料等均高壓消毒，喂養(yǎng)自來水和標(biāo)準(zhǔn)實驗大鼠飼料，能正常自由飲食、飲水，白天光照時間及黑暗時間各12 h，大鼠應(yīng)用物品每隔3 d進(jìn)行消毒、適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，鼠房內(nèi)有空調(diào)、排氣扇，實驗室溫度維持于(24～26)℃，飼養(yǎng)過程達(dá)到SPF級標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 模型建立 大鼠造模前均接受10 h禁食、禁水。模型對照組及柴胡皂苷組采用反復(fù)腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品化學(xué)點燃法[7]，癲癇模型制作具體如下：健康SD大鼠首次予以氯化鋰腹腔注射(127 mg/kg)，18 h～24 h后予以硫酸阿托品注射液1 mg/kg，30 min后行腹腔注射羅皮卡品10 mg/kg；若大鼠未出現(xiàn)持續(xù)癲癇狀態(tài)則每30 min腹腔注射羅皮卡品10 mg/kg，至大鼠出現(xiàn)持續(xù)癲癇狀態(tài)即停止注射。實驗動物癲癇發(fā)作根據(jù)Racine分級，其中0級為未出現(xiàn)發(fā)作反應(yīng)；Ⅰ級為節(jié)律性口角、耳或面部肌肉等存在抽動陣攣現(xiàn)象；Ⅱ級為大鼠點頭并伴隨嚴(yán)重的面部肌肉抽動陣牽；Ⅲ級為出現(xiàn)前肢陣攣但不伴隨直立；Ⅳ級為前肢陣攣伴隨直立；Ⅴ級為全身強(qiáng)直陣挈發(fā)作，無法站立，經(jīng)常跌倒。癲癇持續(xù)狀態(tài)為大鼠出現(xiàn)連續(xù)Ⅳ級或以上癲癇發(fā)作，時間超過30 min；連續(xù)5次Ⅱ級以上的癲癇發(fā)作大鼠為達(dá)到點燃標(biāo)準(zhǔn)。待持續(xù)癲癇狀態(tài)出現(xiàn)超過60 min時，腹腔注射水合氯醛300 mg/kg終止癲癇發(fā)作，適當(dāng)減半劑量重復(fù)注射1次。癲癇狀態(tài)后24 h內(nèi)大鼠經(jīng)過急性期，此期間7只大鼠因抽搐頻繁死亡，之后進(jìn)入潛伏期(約2周)，此期間由于頻繁抽搐和不能自主進(jìn)食衰竭死亡大鼠6只，之后進(jìn)入慢性期，予以腹腔注射5%糖鹽水5 mL，每日1次。監(jiān)控大鼠情況，采用苦味酸進(jìn)行不同標(biāo)記，發(fā)作級別Ⅰ級～Ⅳ級，此期間無大鼠死亡，觀察錄像回放，Ⅳ級或以上癲癇發(fā)作證實造模成功，為癲癇自發(fā)發(fā)作模型，若未達(dá)到Ⅳ級則棄用。

1.2.3 分組及給藥方法 將制備成功的癲癇大鼠模型隨機(jī)分為模型對照組及柴胡皂苷組，各15只，另選擇15只正常大鼠作為正常對照組。柴胡皂苷組予以腹腔注射柴胡皂苷懸濁液1.09 mL/(kg·d)，模型對照組及正常對照組均給予等量0.9%氯化鈉溶液，使用方法、劑量及使用頻率與柴胡皂苷組完全相同至實驗結(jié)束。每日喂養(yǎng)全價飼料，自由飲水，保證充足飲水，維持每日人工排尿3次。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 癲癇發(fā)作行為記錄 研究期間，采用Vedio于08：00～20：00連續(xù)監(jiān)測大鼠造模成功后、治療后4周、8周癲癇發(fā)作次數(shù)、平均發(fā)作時間變化，測量大鼠體重。

1.3.2 大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)谷氨酸及γ-羥基丁酸含量檢測 各組大鼠予以乙醚過量麻醉，迅速斷頭處死大鼠，并置于0 ℃下冰盤內(nèi)，采用高溫消毒手術(shù)器械，取出全腦，采用濾紙吸除血液，迅速掀開大腦皮層，剪碎，置于甲醛液內(nèi)固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，海馬連續(xù)冠狀切片。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測谷氨酸及γ-羥基丁酸水平。采用粘片劑(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APES)進(jìn)行預(yù)處理，多聚甲醛40 g/L及磷酸鹽緩沖液0.1 mol/L固定處理，切片常規(guī)脫蠟入水，溫室放置10 min，蒸餾水洗滌3次～5次，磷酸鹽緩沖液浸泡5 min，檸檬酸鹽緩沖液和切片共同放置于壓力鍋內(nèi)加熱至沸騰，沸騰1 min～2 min離開熱源，室溫放置20 min，自然冷卻，蒸餾水和磷酸鹽緩沖液各沖洗2次，每次3 min，滴入牛血清白蛋白(BSA)封閉液50 g/L，溫室放置20 min后甩掉封閉液，37 ℃孵育1 h～2 h。磷酸鹽緩沖液3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，孵育、洗滌后滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)，1 mL蒸餾水分別滴加DAB試劑盒中A、B、C試劑各1滴，洗滌、脫水、透明、封固。顯微鏡觀察，顯示棕黃色顆粒者為陽性，皮質(zhì)和海馬以磷酸緩沖液代替，孵育切片，分別選擇皮質(zhì)和海馬部位10個具有代表性的高倍視野(×100)，計算每個視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)，觀察神經(jīng)元變化。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)作時間比較 造模期間，致癇大鼠均存活，并且出現(xiàn)癲癇自發(fā)發(fā)作，發(fā)作等級Ⅰ級～Ⅳ級，并逐漸從Ⅰ級發(fā)展至Ⅳ級，所有大鼠均存活至實驗結(jié)束。造模成功后，模型對照組與柴胡皂苷組癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后4周、8周，與模型對照組比較，柴胡皂苷組癲癇發(fā)作次數(shù)少、發(fā)作時間短，且柴胡皂苷組發(fā)作次數(shù)、發(fā)作時間呈持續(xù)降低趨勢(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)作時間比較(±s)

2.2 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)谷氨酸陽性細(xì)胞數(shù)量比較 與正常對照組比較，模型對照組及柴胡皂苷組皮質(zhì)和海馬區(qū)谷氨酸陽性細(xì)胞數(shù)較多(P<0.05)；與模型對照組比較，柴胡皂苷組皮質(zhì)和海馬區(qū)谷氨酸陽性細(xì)胞數(shù)較少(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)谷氨酸陽性細(xì)胞數(shù)量比較(±s) 個/張

2.3 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)γ-羥基丁酸陽性細(xì)胞數(shù)量比較 治療后，與正常對照組比較，模型對照組及柴胡皂苷組皮質(zhì)和海馬區(qū)γ-羥基丁酸陽性細(xì)胞數(shù)較少(P<0.05)；與模型對照組比較，柴胡皂苷組皮質(zhì)和海馬區(qū)γ-羥基丁酸陽性細(xì)胞數(shù)較多(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)γ-羥基丁酸陽性細(xì)胞數(shù)量比較(±s) 個/張

3 討 論

癲癇是一組由于多種因素引起腦部神經(jīng)元高度同步化，伴自限性異常放電所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常為特征的綜合征[8]，病人發(fā)作持續(xù)時間短暫，可能數(shù)秒、數(shù)分?jǐn)?shù)或數(shù)十分鐘，基本不超過半小時。各國癲癇發(fā)病率不同，與地理環(huán)境及社會經(jīng)濟(jì)狀況有關(guān)。根據(jù)WHO統(tǒng)計報道顯示，癲癇的患病率在不同發(fā)達(dá)程度國家患病率不同，根據(jù)發(fā)達(dá)程度患病率分別為0.5%、0.61%、0.72%、1.12%[9]，全球約超過5 000萬癲癇病人[10]。反復(fù)癲癇導(dǎo)致病人出現(xiàn)智力減退、神經(jīng)異常及記憶力低下等癥狀，使其社會適應(yīng)能力降低。70%～80%病人需長期應(yīng)用抗癲癇藥物[11]，長期服用此類藥物出現(xiàn)嗜睡、困倦及注意力不集中等不良作用，長期反復(fù)癲癇發(fā)作可能誘發(fā)癡呆等不良結(jié)局[12]。

中醫(yī)認(rèn)為癲癇屬于“癇癥”范疇，有研究發(fā)現(xiàn)，癲癇“從肝論治”湯藥——復(fù)方柴胡疏肝湯能抑制戊四氮(PTZ)所致癲癇大鼠的癇癥發(fā)作，通過抑制P-糖蛋白(P-GP)表達(dá)實現(xiàn)[13]。中藥柴胡屬于解表藥物，具有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉陷的功效，藥理學(xué)研究證實柴胡能抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)皮質(zhì)醇分泌等多種作用。在柴胡有效成分的相關(guān)探討中逐步篩選得出此藥中有效成分柴胡皂苷具有抗驚厥作用，對抗PTZ致癇，有效保護(hù)小鼠強(qiáng)制性驚厥發(fā)生，抑制癲癇發(fā)作[14]。本研究結(jié)果顯示，造模成功后，模型對照組與柴胡皂苷組癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作平均時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后4周、8周，與模型對照組比較，柴胡皂苷組癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作平均時間降低，且柴胡皂苷組發(fā)作次數(shù)、發(fā)作時間呈持續(xù)降低趨勢(P<0.05)。提示柴胡皂苷對癲癇大鼠具有良好的治療作用，可減少癲癇發(fā)作次數(shù)及縮短發(fā)作時間。

癲癇的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但有關(guān)本病與神經(jīng)遞質(zhì)的研究較多，有研究顯示，本病的發(fā)生發(fā)展與谷氨酸、天門冬氨酸、γ-氨基丁酸及甘氨酸等多種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)失衡有關(guān)[15]。上述遞質(zhì)失衡誘發(fā)神經(jīng)元異常放電，神經(jīng)元放電頻率提高，無限制擴(kuò)散至臨近神經(jīng)元，促使癲癇發(fā)作。谷氨酸是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量較高的興奮性氨基酸，可誘發(fā)神經(jīng)元持續(xù)去極化，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流[16]，使胞漿內(nèi)過量Ca2+產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，誘發(fā)興奮性氨基酸及其類似物神經(jīng)元死亡的共同病理生理機(jī)制[17]。γ-氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能有效阻斷興奮的擴(kuò)散，并參與興奮傳導(dǎo)過程。γ-氨基丁酸的合成水平降低誘發(fā)神經(jīng)元的興奮無法控制，癲癇發(fā)作[18]。大量實驗證實，γ-氨基丁酸受抑制是癲癇發(fā)生的主要病理生理機(jī)制及原因[19]。本研究證實，與正常對照組比較，模型對照組及柴胡皂苷組皮質(zhì)和海馬區(qū)谷氨酸陽性細(xì)胞數(shù)較高，γ-羥基丁酸陽性細(xì)胞數(shù)較少(P<0.05)；與模型對照組比較，柴胡皂苷組皮質(zhì)和海馬區(qū)谷氨酸陽性細(xì)胞數(shù)較少，γ-羥基丁酸陽性細(xì)胞數(shù)較多(P<0.05)。提示柴胡皂苷能提高癲癇大鼠γ-羥基丁酸免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞含量，下調(diào)谷氨酸水平，以緩解癲癇發(fā)作。

綜上所述，柴胡皂苷通過提高癲癇大鼠γ-羥基丁酸免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞含量，下調(diào)谷氨酸水平，從而改善皮質(zhì)和海馬腦區(qū)的神經(jīng)電生理功能，降低神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，保護(hù)神經(jīng)元，抑制癲癇發(fā)作，但其具體途徑和機(jī)制需進(jìn)一步研究。