17β-雌二醇浸浴對小黃魚早期生長及性腺發(fā)育的影響

周鋒祺，謝慶平，樓 寶，孟祥磊，何 雪，孫 毅，詹 煒，陳睿毅，劉 峰，王立改，徐冬冬

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021；2.嵊泗縣海洋與漁業(yè)局，浙江嵊泗 202450）

魚類生存的水域環(huán)境分布廣泛、自身種類豐富，其性別決定也具有多樣性[1]。同時，魚類的性別也具有高度的可塑性[2]，性別除了由遺傳因素決定外，還可以通過環(huán)境因素產(chǎn)生影響，這些因素包括類固醇激素、溫度、密度等[3-4]。類固醇激素對性別影響的研究中，以雌激素（雌二醇17β-estradiol，E2）較多，雌二醇是一種常用的誘導(dǎo)雌性化的類固醇激素，即使在低濃度下也具有高效的雌激素效應(yīng)[5]，因此被認(rèn)為是性別決定過程中的關(guān)鍵因子。例如：方永強等[6]使用E2濃度為10 mg/kg誘導(dǎo)實驗中，鯔魚Mugil cephalus有90%以上的雌性率；張曉彥等[7]通過浸浴E2的方式，對半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis的處理中，1 μg/L和30 μg/L的雌性率分別為74%和97%。誘導(dǎo)魚類雌性化的方法通常有投喂、浸浴、注射和埋植雌激素，這些方法都可以誘導(dǎo)產(chǎn)生性逆轉(zhuǎn)的雌魚，但過量的激素處理也會影響其生長發(fā)育，不足又會導(dǎo)致誘導(dǎo)不成功。

小黃魚Larimichthys polyactis俗稱厚鱗仔、黃花魚、小黃瓜，是我國重要的經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)魚類之一，為渤、黃、東海群眾及機(jī)輪漁業(yè)的主要捕撈對象[8]。由于過度捕撈，環(huán)境污染，氣候環(huán)境變化等原因，小黃魚捕撈量急劇下降，捕獲的小黃魚個體表現(xiàn)出日趨小型化、性成熟提前的現(xiàn)象，種質(zhì)資源退化相當(dāng)嚴(yán)重，已經(jīng)無法滿足人們的消費需求[9-11]。2000年，在黃海南部捕撈野生小黃魚的雌雄性比平均為1:2.7；且形態(tài)上雌性的體形比雄性稍大[12]。2015年，小黃魚全人工繁殖技術(shù)取得成功[13]，人工養(yǎng)殖試驗過程中也發(fā)現(xiàn)雌魚體型比雄魚偏大，更具有經(jīng)濟(jì)價值。因此，實現(xiàn)小黃魚全雌化育種成為了現(xiàn)有階段的主要目標(biāo)，本研究用不同濃度雌激素E2誘導(dǎo)孵化后17 d的小黃魚，通過常規(guī)測量及組織切片觀察的方法研究該藥物對小黃魚生長和性腺發(fā)育的影響，為研究小黃魚性別分化的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗時間從2017年5月開始，在浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒漁業(yè)科技島海水魚類營養(yǎng)聯(lián)合實驗室進(jìn)行實驗。實驗魚苗為浙江省海洋水產(chǎn)研究所自主人工繁育的F3代魚苗，在500 L藍(lán)色玻璃鋼水缸中孵化、養(yǎng)殖。實驗所用海水為經(jīng)高位池沉淀和砂濾池過濾處理之后的海水，由于小黃魚人工自然水溫養(yǎng)殖環(huán)境下雌雄性比近似為1:1，因此本實驗水溫采用自然水溫，實驗期間水溫范圍為19～27℃，鹽度29左右，供氧充足。實驗前期投喂輪蟲、豐年蟲和橈足類，孵化后15 d開始投喂配合飼料，每日4次，定時、飽食。

1.2 實驗設(shè)計及樣品處理

實驗用藥品采用浸浴的方式，即直接將配置好濃度的藥品加入養(yǎng)殖缸體中。本研究E2處理魚的浸浴液的配制是先將純度為99%的E2粉末藥品（Sigma，德國）用95%乙醇溶解，配置成4 mg/mL的浸浴液母液，并避光保存。設(shè)置 3 個浸浴實驗組，浸浴濃度分別為 1（E1）、10（E10）、50（E50）μg/L；即分別在養(yǎng)殖缸體400 L水中分別直接加入0.1、1和5 mL浸浴液母液，同時設(shè)置2個對照組：95%乙醇組C（95%）和正常養(yǎng)殖組C（0，無任何添加）。在小黃魚孵化17 d時開始進(jìn)行浸浴實驗，按實驗濃度梯度1、10和50 μg/L分別于水缸中浸浴，C（95%）按照E2 50 μg/L的添加量，加入同等體積5 mL 95%乙醇。每日斷水浸浴2 h，浸浴后充分換水并開啟流水，保證藥物在水體中無殘留，持續(xù)60 d。分別在浸浴處理20、40和60 d時測量體長（精確到0.1 cm）、體重（精確到0.01 g）、性腺重等數(shù)據(jù)并進(jìn)行性腺取材。20、40和60 d C（0）數(shù)據(jù)取自同期水泥池人工繁育魚苗。

1.3 組織切片觀察

性腺組織用1:15以上體積的波恩氏液固定過夜，石蠟包埋性腺，梯度乙醇脫水：75%乙醇3次，每次5 min；80%乙醇 1次，2 min；90%乙醇 1次，2 min；95%乙醇 1次，2 min；100%乙醇 3次，每次 2 min；乙醇二甲苯混合液（V:V=1:1）1次，10 min。二甲苯透明：二甲苯I 1次，時間隨材料大小變動，材料越大時間越長；二甲苯II 1次，時間隨材料大小變動，直至材料透明。浸臘：二甲苯石蠟混合液（V:V=1:1）1 h；石蠟2 h；包埋：材料整齊擺放在平皿內(nèi)，將液體石蠟倒入平皿，保證石蠟?zāi)毯罂梢越]材料，水平室溫放置，待其凝固后4℃保存。切片采用橫切，厚度為5 μm。使用RM2245切片機(jī)（萊卡，德國）。

1.4 H.E（蘇木精-伊紅）染色

對材料進(jìn)行石蠟切片HE染色，用于觀察性腺組織結(jié)構(gòu)，步驟如下：二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水至75%乙醇后，蘇木精染色：蘇木精，10 s左右；自來水反藍(lán)：流水沖洗，15 min；超純水，2 min；酸水分色（可不用），10 s左右；梯度乙醇脫水：70%乙醇，2 min；80%乙醇，2 min；95%乙醇，2 min；伊紅染色，依情況而定30～60 s；95%乙醇沖洗，2 次；100%乙醇脫水，2 min；二甲苯透明：1/2 二甲苯+1/2 乙醇，10 min；二甲苯 I，10 min；二甲苯Ⅱ，10 min；中性樹膠封片。通過Carl Zeiss Axio Imager A2（蔡司，德國）顯微鏡拍照，觀測性腺組織的結(jié)構(gòu)和發(fā)育狀況，并判斷性別。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)通過SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，單因素方差分析（One-Way ANOVA）跟隨Duncan氏檢驗各生長參數(shù)的顯著性水平，P＜0.05為顯著。

數(shù)據(jù)中性腺成熟系數(shù)（Gonadosomatic index，GSI）的計算公式為：（性腺重/體重）×100%。

2 實驗結(jié)果

2.1 E2浸浴對小黃魚早期生長發(fā)育的影響

采用不同濃度的雌激素E2（1、10和50 μg/L）對孵化后17 d的小黃魚進(jìn)行持續(xù)60 d浸浴，結(jié)果表明，隨著浸浴激素濃度的升高，3種不同濃度浸浴組與對照組C（95%）、C（0）相比，小黃魚的體型呈減小趨勢（圖1a）。采集并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析各實驗組體長與體重，結(jié)果顯示，在20 d時，實驗組組間在體長和體重上均沒有顯著性差異（P＞0.05），對照組 C（95%）和 C（0）高于各實驗組且有顯著性差異（P＜0.05）；在 40 d 時，實驗組組間在體長上沒有顯著性差異，但體重方面，E50顯著性低于E10與對照組C（95%）、C（0），但與E1沒有顯著性差異，E10與C（95%）、C（0）無顯著性差異，且顯著高于E1與E50。在60 d時，小黃魚E10與E50相比體長和體重均無顯著性差異，且兩者顯著低于E1與對照組C（95%）、C（0），E1與對照組相比，體長與體重均顯著低于對照組C（95%）、C（0），兩個對照組之間無差異（圖1b）。

圖1 不同浸浴濃度雌激素（E2）對小黃魚生長發(fā)育的影響Fig.1 Effects of different concentrations of estrogen （E2）on the growth of L.polyactis

2.2 E2浸浴對小黃魚性腺發(fā)育及性腺成熟系數(shù)的影響

于60 d時，秤取不同濃度浸浴實驗組和對照組C（95%）、C（0）性腺重量，區(qū)分對照組雌雄并分別計算GSI。統(tǒng)計學(xué)分析表明，實驗組 E1、E10、E50 和 C（0）雌性相比GSI沒有顯著性差異，并且這四組顯著高于C（95%）雄性、C（95%）雌性和 C（0）雄性（圖 2）。

對E2不同濃度浸浴組（1、10和 50 μg/L）及對照組C（0）雌性、C（0）雄性、C（95%）雄性和 C（95%）雌性小黃魚于60 d時進(jìn)行解剖學(xué)觀察，由于性腺在腹腔內(nèi)難于辨認(rèn)，因此滴加波恩氏液再進(jìn)行拍照，結(jié)果表明，對照組C（0）性腺已經(jīng)產(chǎn)生較為明顯的雌雄差異，C（0）卵巢與C（0）精巢相比性腺發(fā)育較粗、飽滿、易識別；E1和E10與C（0）卵巢相似，但性腺長度更短，性腺頭端更加粗短，隨著濃度的升高，更加傾向于圓柱形，E50性腺發(fā)育畸形，魚鰾末端與性腺末端相連，形成塊狀。C（95%）卵巢與精巢從外觀上無法準(zhǔn)確辨認(rèn)雌雄，且它們之間的GSI數(shù)據(jù)沒有顯著性差異（圖3）。

圖2 不同浸浴濃度雌激素E2對小黃魚性腺成熟系數(shù)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of estrogen （E2）on Gonadosomatic index of L.polyactis

圖3 不同浸浴濃度雌激素E2及對照組小黃魚性腺解剖學(xué)觀察Fig.3 The morphology and anatomical observation of gonads in different concentrations of estrogen （E2）and control groups of L.polyactis

2.3 E2浸浴小黃魚性腺組織學(xué)觀察

組織學(xué)觀察不同浸浴濃度E2及對照組小黃魚性腺（圖4）。結(jié)果表明，60 d時對照組C（0）卵巢已出現(xiàn)二時相至三時相卵母細(xì)胞，并伴有卵巢腔，而C（0）精巢仍然未開始減數(shù)分裂，性腺充滿精原細(xì)胞。C（95%）卵巢雖出現(xiàn)了二時相的卵母細(xì)胞，但整個卵巢發(fā)育不飽滿，體細(xì)胞較多，呈現(xiàn)出發(fā)育滯后的狀態(tài)；C（95%）精巢則形態(tài)松散，只見少量的精原細(xì)胞。E1、E10、E50組均出現(xiàn)二時相至三時相卵母細(xì)胞，E1、E10組有明顯卵巢腔，E50組性腺形狀非圓形。

圖4 不同浸浴濃度雌激素（E2）及對照組小黃魚性腺組織學(xué)觀察Fig.4 Histological observation of the gonads in different concentrations of estrogen （E2）of L.polyactis

通過組織切片觀察，統(tǒng)計不同雌激素E2浸浴組及對照組小黃魚性別比例情況，結(jié)果表明，E1的雌性率為82%，E10為88%，E50為63%，當(dāng)濃度達(dá)到E10以上時，未發(fā)現(xiàn)雄性及未分化性腺，且隨著濃度的上升，出現(xiàn)畸形的比率上升。C（95%）養(yǎng)殖的雌雄性別比例與C（0）的雌雄性別比例相近，都近似1:1（表1）。

表1 不同雌激素（E2）浸浴對小黃魚性別比例的影響Tab.1 Effects of different concentrations of estrogen （E2）on sex ratio of L.polyactis

3 討論

3.1 雌激素E2抑制小黃魚的生長

本研究中各實驗組濃度均抑制了小黃魚的生長發(fā)育，且隨著E2濃度的升高，抑制作用與對照組相比更顯著。這點主要表現(xiàn)為E2浸浴組在60 dat時體長與體重均顯著性低于對照組。本研究結(jié)果與CARVALHO，et al[14]在小鋸蓋魚Centropomus undecimalis的投喂實驗組，50和100 mg/kg均抑制體長和體重的增長；BULKLEY[15]報道的斑鮰Ictalurus punctatus攝食含有乙基雌酚的餌料時，當(dāng)濃度為2.2 mg/kg會出現(xiàn)生長減慢。及BLáZQUEZ，et al[16]在歐洲鱸Dicentrarchus labrax中也發(fā)現(xiàn)E2會抑制體重的增長結(jié)果相一致。然而，MALISON，et al[17]發(fā)現(xiàn)投喂?jié)舛葹?5 μg/g的含有E2的飼料，可以促進(jìn)金鱒Perca fkvescens的體重增加；李國超[18]選用10 ng/L的E2溶液分別對10 hpf（受精后10 h）的斑馬魚幼魚進(jìn)行處理，得出E2的毒性主要體現(xiàn)在會抑制細(xì)胞增殖和增強皮膚屏障作用，也推測出高濃度E2會影響了某些控制體軸發(fā)育的關(guān)鍵基因的正常表達(dá)。因此E2對小黃魚生長上呈負(fù)面影響，這一點可能是由于E2的毒性所致。這些研究表明雌激素用于魚類生長的實驗，有正負(fù)兩方面的結(jié)果。這取決于對激素種類、劑量的選擇和實驗魚對所用激素、劑量的適應(yīng)性[19]。

3.2 雌激素E2可誘導(dǎo)小黃魚雌性化

由于小黃魚人工自然水溫養(yǎng)殖環(huán)境下雌雄性比近似為1:1，在自然水溫的條件下的人工養(yǎng)殖對小黃魚性腺分化的影響較小，因此本研究水溫采用自然水溫，并沒有對養(yǎng)殖水溫進(jìn)行控制。根據(jù)表1的統(tǒng)計結(jié)果表明，雌激素E2對小黃魚卵巢的分化具有促進(jìn)作用，浸浴低劑量的E2便可提高小黃魚的雌性比例，且E2對性腺的發(fā)育有一定的抑制作用，隨著濃度的升高，會出現(xiàn)性腺發(fā)育畸形的現(xiàn)象。本研究結(jié)果與MEIJIDE，et al[20]在玉麗體魚Cichlasoma dimerus中浸浴濃度為1 μg/L的E2誘導(dǎo)雌性率為88.5%，實驗中出現(xiàn)了兼性性腺但未發(fā)現(xiàn)不育性腺一致，而BLáZQUEZ，et al[16]在歐洲鱸中雌激素投喂實驗發(fā)現(xiàn)在受精后60～260 d的期間E2誘導(dǎo)會出現(xiàn)兼性和不育性腺，乙炔基雌二醇（17α-ethynylestradiol，EE2）誘導(dǎo)會出現(xiàn)不育性腺，正常雌性誘導(dǎo)率分別為13%和80%，在48～88 dpf時期段EE2處理不會發(fā)生畸形性腺的現(xiàn)象，在226～426 dpf時期段E2處理會發(fā)生兼性性腺的現(xiàn)象。王星等[21]在E2濃度為259、1 180 ng/L的浸浴處理中，稀有鮈鯽Gobiocypris rarus雄性性腺則出現(xiàn)了明顯的萎縮現(xiàn)象，精巢組織中的大量生殖細(xì)胞被脂肪組織取代，精巢生殖細(xì)胞數(shù)量減少。本研究中E2處理從低濃度到高濃度都有部分畸形性腺發(fā)生，由于處理時期較早，未發(fā)現(xiàn)兼性性腺。PANDIAN，et al[22]總結(jié)出類固醇激素處理會導(dǎo)致部分魚類兼性性腺或性腺不育。雌激素的處理的時間和種類對性腺發(fā)育和分化也會有相應(yīng)影響。

3.3 乙醇抑制小黃魚性腺的發(fā)育

本研究中，低劑量的乙醇浸浴對小黃魚幼魚的生長發(fā)育及性別分化影響較小，這主要體現(xiàn)在乙醇浸浴組與無添加乙醇對照組體長體重均無顯著差異，及這兩組中性別比例都近似1:1。但乙醇浸浴對性腺的發(fā)育具有抑制的作用，這體現(xiàn)在95%乙醇浸浴組與不添加乙醇組的GSI水平前者顯著低于后者。在哺乳動物研究中，CALLEJA，et al[23]認(rèn)為酒精通過不同的機(jī)制產(chǎn)生的毒性，會導(dǎo)致許多激素的變化，導(dǎo)致性腺器官的功能障礙和不育的問題，在白鼠的酒精處理實驗中也發(fā)現(xiàn)白鼠的體重增加緩慢，睪丸體積減小且抑制精小管的發(fā)育，這與本研究結(jié)果一致。而OXENDINE，et al[24]在青鳉Oryzias latipes受精卵發(fā)育0～3、3～6和6～9 d三個時期分別暴露在0.1%、0.5%和1%的乙醇濃度下，結(jié)果現(xiàn)實三種乙醇浸浴濃度均抑制了青鳉魚頭寬的增長。體長的生長在0～3和6～9 d這兩個時期受抑制最為明顯，這一點與本研究不同，可能是由于本研究所加的乙醇濃度非常低所致。因此，根據(jù)乙醇暴露劑量的不同，會對仔魚生長和性腺發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度（1、10和50 μg/L）E2浸浴都將引起小黃魚群體的雌性化并抑制身體生長，隨著濃度的升高，抑制作用越顯著。綜合比較雌性化率及產(chǎn)生畸形率得出當(dāng)E2濃度為10 μg/L時，誘導(dǎo)效果最好，主要表現(xiàn)在雌性率最高。