小窩蛋白-3/RISK介導(dǎo)HBO-PC對心肌的保護作用研究*

袁利邦，殷亮，秦福恩，劉洪，查鵬，付海鈺，鞏固

（成都軍區(qū)總醫(yī)院 麻醉科，四川 成都 610083）

缺血再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）損傷是多因素、多途徑參與的病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，高壓氧預(yù)處理（hyperbaric oxygen preconditioning, HBOPC）可通過提高機體抗氧化損傷能力[1]、調(diào)控血管生長因子[2]和血紅素氧化酶[3]的表達，減輕心肌I/R損傷。心肌的細胞膜小窩蛋白-3（Caveolin-3, Cav-3）[4]可通過影響下游再灌注損傷挽救激酶（reperfusion injury salvage kinase, RISK）通路，保護心肌[5]。但Cav-3/RISK是否介導(dǎo)HBO-PC的心肌保護作用尚無報道。本文復(fù)制H9c2心肌細胞缺氧復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation, H/R）模型，旨在探討HBO-PC保護心肌的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 細胞及試劑 H9c2心肌細胞（中國科學院上海細胞庫），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal calf serum,FBS）購自美國Hyclone公司，丙二醛（Malonaldehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）檢測試劑盒購自美國Sigma公司，一氧化氮NO測定試劑盒（上海恒遠生物有限公司），Protein A/G Plus-Agarose、蛋白激酶C（protein kinase, PKC）抑制劑Chelerythrine（CHE）、RISK通路激酶抑制劑LY294002和PD98059購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.2 抗體 兔單抗Caspase-3（1∶1 000）、兔單抗Cleaved caspase-3（1∶500）、兔單抗胞外信號調(diào)節(jié) 激 酶（extracellular signal-regulated kinases, ERK）1/2（1∶ 1 000）、兔單抗 p-ERK1/2（1∶ 500）、兔單抗磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）（1∶1 000）、兔多抗p-PI3K（1∶500）、兔單抗蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）（1∶1 000）、兔單抗p-Akt（1∶1 000）、鼠單抗糖原合酶激酶（glycogen synthase kinase, GSK）3β（1∶ 1 000）、兔單抗p-GSK-3β（1∶500）購自美國Cell Signaling Technology公司，兔多抗Bcl-2（1∶500）、兔單抗PKCε（1∶1 000）及兔多抗Cav-3（1∶500）購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Sorvall Stratos型高速冷凍離心機、Heracell 150I型細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司，Synergy HT型酶標儀（美國BioTek公司），YLC0.5/1A型嬰兒HBO艙（武漢中國船舶重工集團公司第701研究所），共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

37℃、5%二氧化碳CO2條件下，用DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2心肌細胞，選用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。實驗設(shè)計主要分2部分：①探究HBO-PC對心肌I/R損傷的作用，將細胞分為正常培養(yǎng)的對照組、H/R組及HBO-PC+H/R組；②探討HBO-PC對心肌I/R損傷的作用機制，將細胞分為正常培養(yǎng)的對照組、H/R組、HBO-PC+H/R組及HBO-PC+H/R+激酶抑制劑組。HBO-PC條件：純氧洗艙10 min，0.28 MPa穩(wěn)壓1 h，加壓和減壓過程控制至5 min。HBO-PC后2 h開始復(fù)制H/R模型。CHE、LY294002及PD98059作用于心肌細胞的終濃度分別為1、40和25μmol/L。

1.3 H/R模型的復(fù)制

培養(yǎng)心肌細胞至融合度為80%～90%，將完全培養(yǎng)液換成無糖Tyrode’s溶液，持續(xù)通入含95%氮氣N2和5% CO2的混合氣體，形成密閉缺氧空間，以模擬缺血。4 h后換含糖Tyrode’s溶液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，該過程為復(fù)氧，以模擬再灌注。復(fù)制H/R模型后換成DMEM完全培養(yǎng)液進行正常培養(yǎng)，或者加入激酶抑制劑作用心肌細胞，24 h后收集細胞或者培養(yǎng)液進行后續(xù)檢測。

1.4 收集富含Cav-3的膜片段

按照文獻[6]的方法，收集各組心肌細胞，加入2 ml 0.5 mol/L Na2CO3溶液（pH 11.0）重懸并勻漿。向勻漿液中加入2 ml 90%蔗糖溶液，一起轉(zhuǎn)移至超速離心管中，加入4 ml 35%蔗糖溶液和4 ml 5%蔗糖溶液，10 000 r/min離心18～20 h，用樣品管從上向下梯度收集液體，1 ml/管，共12管，其中4～6 ml部分為富含小窩蛋白的部分。2 000 r/min離心2 h收集該部分沉淀，加入蛋白裂解液，超聲裂解后所得蛋白樣品進行Western blot檢測。

1.5 免疫共沉淀

各組心肌細胞裂解后離心取上清，進行蛋白定量。取500μg蛋白樣品與2μg兔多抗Cav-3一抗混勻，4℃孵育2 h，加入20μl Protein A/G Plus-Agarose，4℃震蕩過夜。離心收集沉淀，PBS洗滌4次，加入1×SDS樣品緩沖液重懸，95℃變性5 min，Western blot檢測PKCε的含量。

1.6 免疫熒光染色

心肌細胞經(jīng)爬片、4%多聚甲醛固定和0.1%Triton X-100透化后，加入10%羊血清常溫孵育30 min，PBS洗滌后加入一抗孵育，4℃過夜。PBS充分洗滌后加入帶有熒光標記的二抗，避光常溫孵育2 h，PBS充分洗滌后用95%甘油封片，共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.7 SOD、MDA、LDH和NO的檢測

收集細胞和培養(yǎng)液，將細胞裂解后離心取上清，按照SOD、MDA、LDH和NO檢測試劑盒說明書進行操作，根據(jù)測定結(jié)果計算各組細胞內(nèi)SOD和MDA、以及細胞培養(yǎng)液中LDH和NO的含量。

1.8 Western blot檢測

由心肌細胞提取的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入兔單抗Caspase-3、Cleaved caspase-3、PKCε、ERK1/2、Akt、PI3K、p-ERK1/2、p-Akt、p-GSK-3β，鼠單抗GSK-3β，兔多抗p-PI3K、Bcl-2、Cav-3，4℃孵育過夜。PBST洗膜后加入HRP標記的兔抗大鼠IgG（1∶5 000），常溫孵育2 h，PBST洗膜，進行ECL反應(yīng)，分析蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HBO-PC減輕心肌I/R損傷

2.1.1 3組SOD、MDA、LDH、No的含量變化 對H9c2細胞予以HBO-PC處理，復(fù)制H/R模型24 h后，對 照 組、H/R組、HBO-PC+H/R組 的SOD、MDA、LDH、NO含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，H/R組與對照組的MDA、LDH、SOD和NO含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示H/R升高MDA和LDH含量，降低SOD和NO含量；HBO-PC+H/R組與H/R組的MDA、LDH、SOD和NO含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示HBO-PC+H/R組MDA和LDH含量低于H/R組，SOD和NO含量高于H/R組。見表1。

2.1.2 3組Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量比較 對照組、H/R組、HBO-PC+H/R組H9c2細胞中Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，H/R組與對照組的Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示H/R可增強Caspase-3活性，增加Bax蛋白表達，減少Bcl-2蛋白表達；HBO-PC+H/R組與H/R組的Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示HBO-PC減弱Caspase-3活性，減少Bax表達，增加Bcl-2表達。見表2和圖1、2。

表1 3組SOD、MDA、LDH、NO含量比較 （±s）

表1 3組SOD、MDA、LDH、NO含量比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與H/R組比較，P ＜0.05

組別 SOD/（u/ml） MDA/（μmol/L） LDH/（u/L） NO/（μmol/L）對照組 210.12±15.33 1.02±0.41 50.60±2.31 4.35±0.36 H/R組 113.58±12.471） 2.84±0.181） 124.05±3.151） 2.27±0.121）HBO-PC+H/R組 175.66±10.292） 1.91±0.322） 78.75±3.462） 3.61±0.252）F值 43.400 24.160 453.900 48.45 P值 0.000 0.001 0.000 0.000

表2 3組Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較 （±s）

表2 3組Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與H/R組比較，P ＜0.05

組別 Caspase-3活性 Bax蛋白 Bcl-2蛋白對照組 0.967±0.076 0.958±0.081 0.970±0.062 H/R 組 1.423±0.0451） 2.713±0.1341） 0.443±0.0511）HBO-PC+H/R 組 1.220±0.5572） 1.743±0.1552） 0.757±0.0782）F值 143.900 50.260 42.960 P值 0.000 0.000 0.000

圖1 3組Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、procaspase-3蛋白的表達

圖2 HBO-PC對H/R處理后H9c2細胞Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

2.2 HBO-PC促進PKCε與Cav-3結(jié)合

對照組、H/R組、HBO-PC+H/R組、HBO-PC+H/R+CHE組的PKCε相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。4組Cav-3、PKCε與Cav-3結(jié)合的相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，H/R組與對照組的PKCε與Cav-3結(jié)合、Cav-3相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示H/R增加PKCε與Cav-3的結(jié)合，下調(diào)Cav-3的表達；HBO-PC+H/R組與H/R組的PKCε與Cav-3結(jié)合、Cav-3相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示HBO-PC進一步增加PKCε與Cav-3的結(jié)合，上調(diào)Cav-3的表達；HBO-PC+H/R+CHE組與HBOPC+H/R組的PKCε與Cav-3結(jié)合相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HBO-PC+H/R+CHE組與HBO-PC+H/R組的Cav-3相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示CHE抑制PKCε與Cav-3的結(jié)合，不影響Cav-3的表達。見表3和圖3～ 5。

2.3 HBO-PC激活RISK通路

對照組、H/R組、HBO-PC+H/R組、HBO-PC+H/R+CHE 組 的（p-ERK1/2）/（ERK1/2）、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K及p-GSK3β/GSK3β比值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，H/R組（p-ERK1/2）/（ERK1/2）、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 及 p-GSK3β/GSK3β 比值高于對照組（P＜0.05）；HBO-PC組（p-ERK1/2）/（ERK1/2）、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K及p-GSK3β/GSK3β比值高于H/R組（P＜0.05）；HBO-PC+H/R+CHE 組（p-ERK1/2）/（ERK1/2）、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 及 p-GSK3β/GSK3β比值低于 HBO-PC+H/R組（P＜0.05）。見表4和圖6。

表3 4組PKCε、Cav-3及PKCε與Cav-3結(jié)合的表達水平比較 （±s）

表3 4組PKCε、Cav-3及PKCε與Cav-3結(jié)合的表達水平比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與H/R組比較，P ＜0.05；3）與HBO-PC+H/R組比較，P ＜0.05

組別 PKCε Cav-3 PKCε與Cav-3結(jié)合對照組 0.970±0.044 0.973±0.041 0.957±0.060 H/R 組 0.960±0.046 0.563±0.0651） 1.137±0.0321）HBO-PC+H/R組 1.007±0.021 0.950±0.0622） 1.560±0.0752）HBO-PC+H/R+CHE 組 1.003±0.087 1.003±0.087 1.220±0.0563）F值 0.549 29.030 56.990 P值 0.663 0.000 0.000

圖3 HBO-PC促進PKCε與Cav-3的結(jié)合 （免疫共沉淀）

圖4 各組PKCε、Cav-3的表達比較 （Western blot檢測）

圖5 HBO-PC促進PKCε與Cav-3的結(jié)合 （免疫熒光染色×100）

表4 4組（p-ERK1/2）/（ERK1/2）、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K及p-GSK3β/GSK3β比值比較 （±s）

表4 4組（p-ERK1/2）/（ERK1/2）、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K及p-GSK3β/GSK3β比值比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與H/R組比較，P ＜0.05；3）與HBO-PC+H/R組比較，P ＜0.05

組別 （p-ERK1/2）/（ERK1/2） p-Akt/Akt p-PI3K/PI3K p-GSK3β/GSK3β對照組 0.950±0.050 0.963±0.023 0.977±0.071 0.997±0.040 H/R組 1.083±0.0291） 1.097±0.0551） 1.133±0.0351） 1.117±0.0291）HBO-PC+H/R組 1.470±0.0662） 1.350±0.0462） 1.637±0.0652） 1.383±0.0312）HBO-PC+H/R+CHE 組 1.180±0.0463） 1.180±0.0263） 1.220±0.0503） 1.150±0.0503）F值 60.000 49.360 73.370 53.240 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 HBO-PC對RISK通路的影響

2.4 RISK通路抑制劑減弱高壓氧對心肌細胞I/R損傷的保護作用

對照組、H/R組、HBO-PC+H/R組、HBO-PC+H/R+LY294002組、HBO-PC+H/R+PD98059組的Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，HBO-PC+H/R+LY294002組與HBO-PC+H/R組的Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示LY294002增強Caspase-3活性，增加Bax表達，減少Bcl-2表達；HBO-PC+H/R+PD98059組與HBO-PC+H/R組的Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示PD98059增強Caspase-3活性，上調(diào)Bax表達，下調(diào)Bcl-2表達。見表5和圖7。

表5 5組Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較 （±s）

表5 5組Caspase-3活性、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與H/R組比較，P ＜0.05；3）與HBO-PC+H/R組比較，P ＜0.05

組別 Caspase-3活性 Bax蛋白 Bcl-2蛋白對照組 0.990±0.060 0.996±0.050 1.010±0.036 H/R組 1.420±0.0801） 3.000±0.1001） 0.467±0.0611）HBO-PC+H/R組 1.090±0.0172） 1.813±0.0802） 1.050±0.0562）HBO-PC+H/R+LY294002組 1.273±0.0673） 2.300±0.1003） 0.700±0.0503）HBO-PC+H/R+PD98059組 1.271±0.0353） 2.303±0.1423） 0.673±0.0703）F值 166.900 58.240 26.990 P值 0.000 0.000 0.000

圖7 RISK通路抑制劑對H9c2細胞凋亡的影響

3 討論

I/R誘發(fā)的心肌細胞功能異常和細胞死亡是心臟病患者發(fā)病率和死亡率增加的主要原因，發(fā)生機制主要與能量代謝障礙、鈣超載、線粒體損傷、細胞自噬和炎癥等有關(guān)[7]。藥物和缺血的預(yù)處理與后處理是臨床研究中比較重要的心肌保護策略。高壓氧自身具有抗氧化功能，可以抑制氧化損傷，是一氧化碳中毒、減壓病和動脈栓塞癥的基礎(chǔ)治療方法，也是創(chuàng)傷愈合和缺血性損傷等疾病的輔助治療手段[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，HBO-PC通過上調(diào)抗氧化酶SOD表達，下調(diào)神經(jīng)炎癥因子環(huán)氧合酶-2表達，抑制神經(jīng)元細胞凋亡，從而減輕缺血性腦損傷；動物模型中，HBO-PC通過調(diào)控心肌PI3K/Akt/Nrf2通路，高壓氧后處理通過降低Caspase-3活性和凋亡蛋白表達，抑制細胞凋亡通路，減輕心肌I/R損傷，從而發(fā)揮心肌保護作用[8]。但是有關(guān)HBO-PC保護心肌的具體機制尚未明確。本研究結(jié)果顯示，HBO-PC能夠減少H/R誘導(dǎo)的心肌損傷標志物LDH、MDA含量和Bax表達、減弱Caspase-3活性，增加抗氧化酶SOD、缺血預(yù)適應(yīng)觸發(fā)因子NO的含量和Bcl-2表達，說明HBO-PC可減少自由基、對抗脂質(zhì)過氧化和抑制細胞凋亡，從而減輕H/R誘發(fā)的心肌細胞損傷。這與之前高壓氧預(yù)/后處理在動物體內(nèi)的研究保持一致[8]。

小窩是細胞膜上的微小結(jié)構(gòu)，小窩蛋白參與多種細胞基本生命活動，如細胞內(nèi)吞、膽固醇運輸、細胞膜組裝、信號傳導(dǎo)等[9]。小窩蛋白有Cav-1、Cav-2和Cav-3 3種亞型，心肌特異性Cav-3過表達可模擬缺血預(yù)適應(yīng)引起的內(nèi)源性心肌保護作用[10]，而Cav-3表達的缺失可阻斷抗氧化系統(tǒng)加重I/R損傷程度[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，缺血損傷后，Cav-3敲除小鼠的存活率低于野生型小鼠，而Cav-3過表達小鼠則對心肌I/R損傷耐受[12]?；罨腜KC亞型，如PKCα、PKCε、PKCδ能夠靶向并結(jié)合心肌細胞小窩結(jié)構(gòu)中的Cav-3蛋白，是活化信號向下游分子轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究報道，缺氧預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)PKC亞型選擇性轉(zhuǎn)位到小窩漿膜，結(jié)合Cav-3蛋白，可導(dǎo)致下游信號分子，如Akt、ERK等的激活[6]。PI3K和ERK信號通路合稱RISK通路，缺血或者藥物的預(yù)/后處理能夠激活該通路，促使開放的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondria permeability transition pore, mPTP）關(guān)閉，促進Ca2+攝取和NO合成、釋放，同時抑制細胞凋亡途徑，進而拮抗I/R損傷的發(fā)生[13-14]。此外，GSK3β是RISK通路下游的效應(yīng)激酶，其磷酸化水平升高預(yù)示酶活性降低[14]。心肌特異性Cav-3過表達的小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，Cav-3促進Akt磷酸化后能夠激活GSK3β的磷酸化，使GSK3β處于失活狀態(tài)，從而抑制mPTP的開放，發(fā)揮保護心肌的作用[10,12]。

本研究結(jié)果顯示，HPO-PC促進PKCε活化轉(zhuǎn)位于小窩并與Cav-3結(jié)合，增加Cav-3蛋白和RISK通路中激酶磷酸化水平的表達，減弱GSK3β活性，但是使用CHE能夠抑制PKC活性，阻斷PKCε與Cav-3結(jié)合，下調(diào)RISK通路中激酶磷酸化水平的表達，增強GSK3β活性，進而減弱HPO-PC的作用。上述結(jié)果表明，HPO-PC能夠通過調(diào)控Cav-3蛋白表達及其與PKCε的結(jié)合，激活下游的RISK通路。此外，本實驗還研究了PI3K抑制劑和ERK抑制劑對HBO-PC與H/R共同處理的心肌細胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種抑制劑可升高Caspase-3活性和Bax表達，降低Bcl-2表達。說明RISK通路抑制劑能夠阻斷HBO-PC對心肌細胞凋亡的拮抗作用，減弱心肌保護作用，加重心肌I/R損傷。綜上所述，HBO-PC可能通過影響PKCε/Cav-3/RISK通路，抑制心肌細胞凋亡，抵抗心肌I/R損傷，發(fā)揮心肌保護作用。