桃仁膝康丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升研究*

李 潔，張 磊，張 虹

河南省洛陽正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院(洛陽 471002)

主題詞 方劑 @桃仁膝康丸 質(zhì)量控制

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)，又稱為膝關(guān)節(jié)增生性關(guān)節(jié)炎或退行性膝關(guān)節(jié)炎，是一種慢性進(jìn)展性骨關(guān)節(jié)疾病。KOA為骨關(guān)節(jié)病中的常見病、多發(fā)病和疑難病，其病程長易反復(fù)發(fā)作，有效治療和預(yù)防膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎已成為重大的公共衛(wèi)生問題。平樂正骨歷經(jīng)200余年的傳承與發(fā)展，已成為系統(tǒng)的獨(dú)具特色的骨傷科學(xué)派。藥物療法是平樂正骨主要的治療方法之一，一向被歷代醫(yī)學(xué)家所重視，創(chuàng)制了不少有效的方劑，一直沿用至今。桃仁膝康丸處方來源于名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，是平樂正骨的傳統(tǒng)藥物，制劑批號：豫藥制字Z20120243(洛)，是由桃仁、紅花、三七、當(dāng)歸、川芎、細(xì)辛、沒藥等十余味藥材組成的復(fù)方制劑。該制劑具有活血止痛，祛風(fēng)濕，補(bǔ)肝腎之功效，適用于骨關(guān)節(jié)病早期關(guān)節(jié)疼痛，屈伸不利，膝部關(guān)節(jié)疼痛，上下樓梯更甚，或久蹲不易站立等癥，經(jīng)多年臨床實(shí)踐表明，該復(fù)方制劑治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎療效顯著，臨床需求量較大。

醫(yī)院制劑在保障人民健康、保證臨床醫(yī)療科研需要、提高醫(yī)院醫(yī)療服務(wù)水平、開發(fā)新藥等方面發(fā)揮著重要的作用，醫(yī)院制劑的質(zhì)量受生產(chǎn)工藝、技術(shù)水平、設(shè)備條件、貯存方法等諸多因素的影響，制劑質(zhì)量控制貫穿制劑生產(chǎn)的全過程和各個環(huán)節(jié)，醫(yī)院制劑的質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)提升是醫(yī)院制劑發(fā)展的重要內(nèi)容。建立和完善醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，切實(shí)加強(qiáng)對制劑各生產(chǎn)環(huán)節(jié)質(zhì)量的監(jiān)督和管理，對于指導(dǎo)藥品生產(chǎn)、保證藥品用藥安全有效等均有著十分重要的意義。桃仁膝康丸是我院醫(yī)院制劑需求量較大的品種之一，臨床療效較好，臨床需求量較大，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有三七、白芍兩味藥的定性鑒別研究，為更好、更有效地控制制劑質(zhì)量，課題組開展了桃仁膝康丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升研究，在定性鑒別研究中，增加了對桃仁膝康丸中當(dāng)歸、川芎、細(xì)辛、防風(fēng)、沒藥等藥味的薄層色譜鑒別方法，在含量測定研究中，增加了采用HPLC法測定獨(dú)活的指標(biāo)性成分二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升，提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

材料與方法

1 材 料

1.1 儀器： AB135-S型分析天平(梅特勒-托利多有限公司)、ZF-7型三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)、HH-S26s型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠)、KH-600DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、Agilent 1100高效液相色譜儀、DAD檢測器、色譜柱Agilent 1100 C18柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)、Agilent化學(xué)工作站。

1.2 藥材與試劑: 阿魏酸對照品(批號：110773-201614)；二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品(批號：111583-201605)；細(xì)辛脂素對照品(批號：111889-201504)；當(dāng)歸對照藥材(批號：120927-201617)；川芎對照藥材(批號：120918-201612)；沒藥對照藥材(批號：天然沒藥120967-201405)；細(xì)辛對照藥材(批號：121204-201606)；防風(fēng)對照藥材(批號：120947-201409)甲醇、乙醇、正丁醇，正己烷、乙醚、石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯等試劑均為分析純，乙腈為色譜純。中性氧化鋁(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20160713)。薄層層析硅膠G(青島海洋化工廠)。

2 方 法

2.1 薄層鑒別:當(dāng)歸、川芎薄層鑒別研究：取桃仁膝康丸(批號;20170921)3 g，研細(xì)為粉末狀，加乙醚20 ml，冷浸0.5 h，時時振搖，濾過后，揮干乙醚，殘渣加乙酸乙酯1 ml，使之溶解，作為樣品溶液。取不含當(dāng)歸、川芎的陰性制劑3 g，照樣品溶液制備方法，制得雙陰性對照溶液。分別取當(dāng)歸、川芎對照藥材粉末各1g，用同樣的方法，制得對照藥材溶液。另取阿魏酸對照品，加甲醇制成含量為1 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。依據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部通則中薄層色譜鑒別法[1]，分別吸取上述五種溶液，各2μL,將其點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60-90℃)：乙酸乙酯(8:3)，作為展開劑，展開，取出并晾干后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。見圖1。

2.2 細(xì)辛的薄層色譜鑒別試驗(yàn)：取桃仁膝康丸(批號;20170921)3 g，研細(xì)為粉末狀，加入甲醇15 ml，超聲處理20 min，過濾，蒸干濾液，殘渣加入1 ml甲醇，使之溶解，作為樣品溶液。取細(xì)辛對照藥材粉末，取樣量為1 g，用同法制得細(xì)辛對照藥材溶液。取不含細(xì)辛的陰性制劑3 g，采用相同方法，制得陰性對照樣品溶液。另取細(xì)辛脂素對照品，加入甲醇，制成含量為1 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。依據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部通則中薄層色譜鑒別法[1]，分別吸取上述四種溶液，各2μL，分別將其點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑及比例：石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5:1)，展開后，取出并晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱，直至斑點(diǎn)的顯色清晰。結(jié)果見圖2。

注：1、2、3為桃仁膝康丸樣品，4為當(dāng)歸對照藥材，5為川芎對照藥材，6為阿魏酸對照品，7為雙陰性對照

注：1、2、3為桃仁膝康丸樣品，4為對照藥材，5為細(xì)辛脂素對照品，6為陰性對照

2.3 沒藥薄層色譜鑒別研究:取桃仁膝康丸(批號：20170921)3 g，研細(xì)為粉末狀，照揮發(fā)油測定法(《中國藥典》2015年版四部通則揮發(fā)法)加石油醚(60-90℃)2 ml，緩緩加熱至沸，保持微沸約3 h，放冷，取石油醚溶液，作為樣品溶液。取沒藥對照藥材粉末2 g，用同樣方法，制得沒藥對照藥材溶液。另取不含沒藥的陰性制劑15 g，同法制得陰性對照溶液。依據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部通則中薄層色譜鑒別法[1]，分別吸取上述三種溶液，各2μl，分別將其點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，展開劑及比例：環(huán)己烷：乙醚(4:1)，展開后，取出并晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，用熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果見圖3。

注：1、2、3為桃仁膝康丸樣品，4為對照藥材，5為陰性對照

圖3 沒藥薄層色譜圖

2.4 防風(fēng)薄層色譜鑒別研究:取桃仁膝康丸(批號;20170921)3 g，研細(xì)為粉末狀，加入甲醇溶液15 ml，振搖后，密塞，超聲處理20 min后，靜置，濾過，蒸干濾液，殘渣用1 ml甲醇使之溶解，作為樣品溶液。取防風(fēng)對照藥材粉末，取樣量1 g，加入甲醇15 ml，用同樣方法，制得對照藥材溶液。取不含防風(fēng)的陰性制劑2 g，用同樣方法，制得陰性對照溶液。另取，升麻素苷對照品，制成含量為1 mg/ml溶液，作為對照品溶液。依據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部通則中薄層色譜鑒別法[1]，分別吸取上述四種溶液，各2μL,分別將其點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑及比例為三氯甲烷-甲醇-冰醋酸(6:1:1)，展開后，取出并晾干，用10%硫酸乙醇溶液噴灑，揮干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果見圖4。

注：1、2、3為桃仁膝康丸樣品，4為對照藥材，5為升麻素苷對照品，6為陰性對照

結(jié) 果

1 色譜條件色譜柱 Agilent 1100 C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；柱溫：30℃；流動相：乙腈-0.5%乙酸水溶液(46：52)；流速：1.0ml/min；檢測波長：330 nm；進(jìn)樣量為20μL，理論塔板數(shù)以二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯計，應(yīng)不低于6000。

2 對照品溶液的制備方法 精密稱定二氫歐芹醇當(dāng)歸酸酯對照品適量，加入甲醇溶液，制得含量為每1 ml含50μg的溶液。

3 供試品溶液的制備方法 取桃仁膝康丸(批號;20170921)，約2.0 g，研細(xì)為粉末狀，精密稱定后，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液20 ml，密塞處理，稱定其重量，超聲提取(功率250 W，頻率40 kHz)30 min后，放至室溫，再稱定其重量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，然后搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即可。

4 陰性供試品溶液的制備 按處方制成缺獨(dú)活的陰性樣品，按上述制備方法，制成缺獨(dú)活的陰性供試品溶液。

5 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取桃仁膝康丸供試品溶液、對照品溶液，以及陰性制劑樣品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按照以上色譜條件測定。陰性樣品在二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的保留時間無干擾峰，方法專屬性良好。

6 線性范圍的考察 取二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品適量，制成每l ml含二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯0.205 mg的溶液，分別精密吸取0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml、0.7 ml于1 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，分別精密吸取上述對照品溶液20μL，注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的回歸方程為Y=4248.1χ-10.571，γ=0.9998。結(jié)果表明，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的進(jìn)樣量在0.420～3.010 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分別進(jìn)樣20 μL，按上述色譜條件測定峰面積。結(jié)果二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量RSD為1.56% (n= 6) ，表明樣品中二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

8 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液(0.205 mg/ml)20 μL，注入色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測定，結(jié)果以二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積計算，RSD為0.98% (n= 6) ，表明儀器精密度良好。

9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取桃仁膝康丸(批號為20170921)6份，按上述供試品溶液制備方法，制得樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積計算，RSD為0.88% (n=6)，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

10 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號桃仁膝康丸樣品(批號20171025)適量，已知含量(1.1462 mg/g)，精密稱定，稱取6份，分別加入二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品溶液(0.43 mg/ml)各2ml，按上述供試品溶液制備方法，制備樣品溶液，注入液相色譜儀，依照以上色譜條件，測定，計算樣品的加樣回收率。見表1。

表1 桃仁膝康丸中二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯加樣回收率

11 樣品含量測定 取3批樣品(產(chǎn)品批號：20170821、20171025、20171127)，依照上述供試品溶液制備方法，制備樣品溶液，分別精密吸取二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對照品溶液、樣品溶液，各20 μL，注入液相色譜儀，按以上色譜條件，測定，外標(biāo)法計算，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的平均含量為1.1253 mg/g。

討 論

在定性鑒別研究中，沒藥的薄層色譜鑒別研究，課題組分別考察了乙醚和乙醇超聲提取結(jié)果，發(fā)現(xiàn)用乙醇提取所得斑點(diǎn)較清晰，分離情況較好。在防風(fēng)薄層色譜鑒別方法研究中，分別考察了不同的展開劑，以及不同展開劑比例的圖譜情況，所考察的展開劑及比例有：三氯甲烷-甲醇(5:1)、乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:1)及三氯甲烷-甲醇-冰醋酸(6:1:1)，發(fā)現(xiàn)以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸(6:1:1)為展開劑時熒光斑點(diǎn)分離較好，較清晰。細(xì)辛的薄層色譜研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在與對照品斑點(diǎn)相應(yīng)位置，供試品溶液和對照藥材溶液斑點(diǎn)均比較模糊，可能與該處方細(xì)辛所占比例較小，該成分含量較低有關(guān)。課題組在二氫歐芹醇當(dāng)歸酸酯的含量測定研究中，分別考察了超聲提取法、冷浸法、回流提取法三種提取方法，測定結(jié)果顯示，超聲提取方法樣品含量較高，且方法簡便易行；考察了提取溶劑甲醇溶液、95%乙醇溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)用甲醇溶液提取，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量較高同時對溶劑用量、提取時間等因素進(jìn)行了考察。由于中藥飲片的產(chǎn)地、炮制，制劑生產(chǎn)及貯藏等諸多因素的影響，均會對成品的有效成分含量產(chǎn)生影響。制劑質(zhì)量是制劑的生命所在，醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制，是保證制劑生產(chǎn)全過程，切實(shí)可行地達(dá)到成品質(zhì)量內(nèi)在一致的重要手段與方法，也是保證醫(yī)院制劑臨床療效的重要前提和保障[2-5]。采用現(xiàn)代質(zhì)量控制技術(shù)，對醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，制劑產(chǎn)品質(zhì)量的升級，必然推進(jìn)各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)的升級，進(jìn)而形成對制劑內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行有效控制，保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的良性循環(huán)[6-8]。

醫(yī)院制劑生產(chǎn)是一項復(fù)雜的工程，包括制劑原料的預(yù)處理、提取、分離、純化、濃縮、干燥、制成制劑等多道工序,每個工序中，有多種工藝參數(shù)需要控制,這些工藝參數(shù)，可直接影響著制劑產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。長期以來，由于技術(shù)條件所限，醫(yī)院制劑不斷改進(jìn)生產(chǎn)工藝參數(shù)，并逐步完善與提高制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以逐步改善同品種不同批次間質(zhì)量參數(shù)差異較大，以及內(nèi)在質(zhì)量均一性較差等突出問題。醫(yī)院中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，應(yīng)以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，運(yùn)用現(xiàn)代藥物質(zhì)量控制理論和方法，對制劑產(chǎn)品建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并通過標(biāo)準(zhǔn)對其質(zhì)量加以控制，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究與質(zhì)量控制是保證醫(yī)院制劑臨床療效穩(wěn)定性的核心所在。醫(yī)院制劑質(zhì)量的好壞不但直接影響其預(yù)防與臨床治療的成效，而且密切關(guān)系到人民群眾的健康與生命安全。只有對醫(yī)院制劑進(jìn)行現(xiàn)代質(zhì)量控制，才能更好的保證醫(yī)院制劑的質(zhì)量，并真正實(shí)現(xiàn)制劑生產(chǎn)與使用的穩(wěn)定、可控，安全與有效、為醫(yī)院制劑的良性奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)。

隨著現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，新工藝、新劑型不斷出現(xiàn)，加之民眾對自身保健意識的增強(qiáng)，人們對于醫(yī)療保健的需求趨于多元化。傳統(tǒng)中藥劑型對于治療疾病有非常重要的作用，但同時也存在給藥劑量大、服用不方便、浪費(fèi)原材料等諸多問題。對現(xiàn)有傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑進(jìn)行二次開發(fā)，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)方法和原理，采用新技術(shù)、新工藝、新輔料、新設(shè)備開發(fā)新劑型，提高制劑水平，優(yōu)化藥物生產(chǎn)制備工藝，制定出科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保用藥的安全、有效、經(jīng)濟(jì)合理，有著非常重要的意義。醫(yī)院制劑以其處方特色、研制周期短、價格便宜、滿足臨床不同需要而日益被社會所接受。然而醫(yī)院制劑存在質(zhì)量控制的規(guī)范性、生產(chǎn)設(shè)備的先進(jìn)性等方面的不足，使得醫(yī)院制劑的質(zhì)量越來越受到廣泛的關(guān)注。許多醫(yī)院有各自的臨床特色和獨(dú)特的醫(yī)療特色，實(shí)現(xiàn)其由傳統(tǒng)的供應(yīng)保證型向技術(shù)開發(fā)型轉(zhuǎn)變，對于發(fā)揮醫(yī)院制劑潛能最大化很有意義的工作[9-10]。

桃仁膝康丸是平樂正骨的傳統(tǒng)藥物，也是我院臨床應(yīng)用最為廣泛、需求量較大的院內(nèi)制劑之一，在治療膝骨性關(guān)節(jié)炎方面療效較好。隨著醫(yī)藥新政策的普及與推廣，應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)手段，對醫(yī)院傳統(tǒng)制劑重新評價研究，使其由傳統(tǒng)供應(yīng)保障型向技術(shù)研發(fā)型轉(zhuǎn)變，以充分發(fā)揮醫(yī)院制劑潛能，進(jìn)一步發(fā)揮醫(yī)藥結(jié)合之優(yōu)勢。本試驗(yàn)對平樂正骨傳統(tǒng)制劑桃仁膝康丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升研究，對該制劑的質(zhì)量控制和進(jìn)一步研發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，對該制劑的進(jìn)一步推廣應(yīng)用具有重要的意義和價值，為醫(yī)院制劑由傳統(tǒng)的供應(yīng)保證型向技術(shù)開發(fā)型轉(zhuǎn)變，提供一定的參考思路與方法。