棘托竹蓀干子實(shí)體與菌絲體抑菌作用的比較研究

諶斌，于方明，何歡，陸兵

(1.廣西高校巖溶生態(tài)與環(huán)境變化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；2.廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西 桂林 541004；3.桂林淮安天然保健品開發(fā)有限公司，廣西 桂林 541004)

竹蓀隸屬于腹菌綱、鬼筆目、鬼筆科、竹蓀屬，常見并可供食用的有4種：長裙竹蓀、短裙竹蓀、紅托竹蓀和棘托竹蓀。竹蓀有著很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用功效，其子實(shí)體中含有21種氨基酸以及多種維生素，同時(shí)它也富含多糖和多種微量元素[1-3]，因而具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗衰老等作用[4-6]。另外，竹蓀對(duì)食品防腐有奇效，“與肉共食,味鮮防腐”，在夏季加入竹蓀的煮熟菜肴可以保持較長時(shí)間不腐敗變質(zhì)，究竟是什么成分在起作用，目前尚不清楚[7]。

竹蓀抑菌作用的研究目前主要集中在竹蓀干子實(shí)體有機(jī)溶劑提取液對(duì)細(xì)菌和真菌的抑制作用上，如檀東飛等對(duì)棘托竹蓀菌蓋的化學(xué)成分及抑菌作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明棘托竹蓀菌蓋的揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌、霉菌、酵母菌有抑制作用[8-10]。而以棘托竹蓀菌絲體作為一種新型食品防腐劑的研究報(bào)道不多。棘托竹蓀是我國科學(xué)工作者于1986年在湖南省會(huì)同縣首次發(fā)現(xiàn)，并于1988年定名的竹蓀新種。該菌香氣濃郁，味道鮮美，現(xiàn)已在我國南方一些地區(qū)大面積栽培。本文就此進(jìn)行了棘托竹蓀干子實(shí)體與菌絲體抑菌作用的比較研究，以期為將棘托竹蓀菌絲體開發(fā)為天然食品防腐劑奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

棘托竹蓀(Dictyophoraechinovolvata)：購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究中心；抗菌性供試菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、黑曲霉(Aspergillusniger)、綠色木霉(Trichodermaviride)等：由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2，用于培養(yǎng)細(xì)菌。

綜合PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，七水硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，自然pH，培養(yǎng)棘托竹蓀、酵母菌和霉菌用。

1.3 主要試劑

乙醇、丙酮、乙酸乙酯：均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 棘托竹蓀干子實(shí)體

購自廣西桂林市七星農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，50 ℃烘干并用粉碎機(jī)粉碎后備用。

1.5 方法

1.5.1 菌株的活化

將保藏于冰箱中的上述菌種接種于相應(yīng)斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)好后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 平板培養(yǎng)基制備

配制好的固體培養(yǎng)基，于121 ℃高壓蒸汽滅菌后，冷卻至45 ℃，在超凈工作臺(tái)中將其傾注于無菌的培養(yǎng)皿中，每皿15 mL，凝固后備用。

1.5.3 供試菌株菌懸液的制備及平板接種

用接種針或接種環(huán)在無菌室中挑取細(xì)菌和真菌少許斜面培養(yǎng)物于裝有9 mL無菌水的試管中，制成菌懸液。大腸桿菌和枯草桿菌，用比濁法計(jì)數(shù)，酵母菌和霉菌孢子用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。調(diào)整菌懸液的濃度至含細(xì)胞數(shù)或孢子數(shù)106～107個(gè)/mL，用移液槍移取0.1 mL菌懸液于平板培養(yǎng)基上，用無菌三角刮鏟將菌液均勻涂布。

1.5.4 棘托竹蓀干子實(shí)體提取液的制備

用電子天平稱取6.00 g棘托竹蓀干子實(shí)體，分成三等份各2.00 g裝于三角錐形瓶中(分別編號(hào)為1,2,3)。在1號(hào)錐形瓶中裝入50 mL乙醇，2號(hào)錐形瓶中裝入50 mL丙酮，3號(hào)錐形瓶中裝入50 mL乙酸乙酯，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱浸泡18 h，過濾并保留濾液，濾渣再各加入50 mL乙醇、丙酮、乙酸乙酯浸泡18 h，過濾后的濾液與前一次的濾液合并。將濾液加熱濃縮后分別得到不同有機(jī)溶劑的棘托竹蓀干子實(shí)體提取液[11,12]。

1.5.5 濾紙圓片測(cè)試培養(yǎng)

用打孔器將新華一號(hào)定性濾紙打成直徑6 mm的小圓紙片，放進(jìn)培養(yǎng)皿中121 ℃高壓蒸汽滅菌，將滅菌濾紙片分別浸入不同的棘托竹蓀子實(shí)體浸提液中浸透。將浸好的濾紙片貼在制備好的接種平板上，將培養(yǎng)皿一分為二，一邊貼提取液濾紙片，一邊貼無菌蒸餾水空白對(duì)照濾紙片，每邊3片[13]。貼好濾紙片的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)菌于35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h，霉菌、酵母菌44～48 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.5.6 棘托竹蓀菌絲培養(yǎng)及其提取液抑菌試驗(yàn)

將活化后的棘托竹蓀斜面菌種菌絲接種于鋪有玻璃紙的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)12天，從玻璃紙刮下培養(yǎng)好的菌絲體并置于三角錐形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯在28 ℃條件下浸提菌絲體18 h，過濾并保留濾液，濾渣再加入50 mL乙酸乙酯浸泡18 h，過濾后的濾液與前一次的濾液合并，將濾液加熱濃縮后得到棘托竹蓀菌絲體提取液，采用濾紙圓片法進(jìn)行棘托竹蓀菌絲體提取液抑菌試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行棘托竹蓀干子實(shí)體提取液抑菌試驗(yàn)。

1.5.7 食物防腐試驗(yàn)

將豬肉、豆腐、土豆切成小塊并等分成5份，分別加入棘托竹蓀濕子實(shí)體粉及其浸提液、棘托竹蓀菌絲體及其浸提液、冷開水(作為對(duì)照樣)，烹熟，置于35～37 ℃下保溫48 h，肉眼觀察食物的動(dòng)態(tài)變化[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 棘托竹蓀干子實(shí)體提取液抑菌作用

棘托竹蓀干子實(shí)體提取濃縮液呈淺黃色，有棘托竹蓀的清香味，抑菌試驗(yàn)的結(jié)果表明棘托竹蓀干子實(shí)體提取液對(duì)細(xì)菌和真菌都有抑制作用，特別是對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制效果；棘托竹蓀子實(shí)體不同提取液對(duì)細(xì)菌和真菌的抑制效果有差別，乙酸乙酯提取液的抑制作用最強(qiáng)，供試菌株被抑制的程度大小依次是：大腸桿菌、枯草桿菌、啤酒酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉、綠色木霉(見表1)。說明棘托竹蓀干子實(shí)體提取液中含有抗菌活性物質(zhì)，具體的有效成分及其抑菌機(jī)理有待以后進(jìn)一步研究探討。

表1 棘托竹蓀干子實(shí)體提取液的抑菌作用

注：+表示有抑菌作用，隨著+增加表示抑菌作用越大，-表示無抑菌作用。

2.2 棘托竹蓀菌絲體乙酸乙酯提取液的抑菌作用

棘托竹蓀菌絲體的乙酸乙酯提取液對(duì)細(xì)菌和真菌有抑制作用，抑制效果和其干子實(shí)體乙酸乙酯提取液的抑菌效果差不多(見表2)，而棘托竹蓀子實(shí)體栽培時(shí)間長達(dá)3～4個(gè)月，且需占用大面積土地,而通過深層培養(yǎng)或固態(tài)靜止培養(yǎng)可快速獲得棘托竹蓀菌絲體，為進(jìn)一步開發(fā)利用棘托竹蓀菌絲體的有效抑菌活性成分提供一定的科學(xué)依據(jù)和可能。

表2 棘托竹蓀菌絲體與干子實(shí)體浸提液的抑菌作用

注：+表示有抑菌作用，隨著+增加表示抑菌作用越大，-表示無抑菌作用。

2.3 食物防腐試驗(yàn)

食物防腐試驗(yàn)的效果見表3。

表3 食物防腐試驗(yàn)

由表3可知，3種食物的對(duì)照系列均有不同程度的腐爛，尤其是肉類，加入冷開水的具有惡臭味。3種食物中加入棘托竹蓀濕子實(shí)體和菌絲體烹熟后的系列在高溫中保存2天的時(shí)間，有微餿味出現(xiàn)，而加入棘托竹蓀子實(shí)體提取液和菌絲體提取液的食物中，只有肉類有少許的餿味，其他2種食物沒有發(fā)現(xiàn)腐敗變質(zhì)。可見棘托竹蓀中確有抑菌成分存在，用乙酸乙酯提取后抑菌效果更佳，棘托竹蓀干子實(shí)體和菌絲體的抑菌效果差不多，為下一步開發(fā)利用棘托竹蓀菌絲體為天然食品防腐劑奠定一定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

棘托竹蓀的干子實(shí)體和菌絲體中均含有抗菌活性物質(zhì)，用乙酸乙酯提取濃縮后抑菌效果更佳，干子實(shí)體和菌絲體的抑菌效果相差不大，而菌絲體可以通過液體發(fā)酵培養(yǎng)在短期內(nèi)大量獲得，相對(duì)容易和簡單，為下一步開發(fā)利用棘托竹蓀菌絲體為天然食品防腐劑奠定一定基礎(chǔ)。