Brefeldin A調(diào)控ATF6通路增強順鉑抑制肺癌細胞增殖的作用

耿娜娜，李學英，鄭 翔，楊 蕾，吳明松

(1.遵義醫(yī)學院 貴州省普通高等學校口腔疾病研究特色重點實驗室暨遵義市口腔疾病研究重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 貴州省普通高等學校微生物資源及藥物開發(fā)特色重點實驗室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學院 口腔醫(yī)學院，貴州 遵義 563099；4.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學遺傳學教研室，貴州 遵義 563099)

肺癌(lung cancer)是全世界癌癥患者死亡的主要原因。其發(fā)病率和死亡率均位居我國惡性腫瘤的首位[1]。對于早期實體腫瘤，手術(shù)切除是首選方案；但對于晚期癌癥患者，多采用化學治療[2]。順鉑(cis-dichlorodiamine platinum，CDDP)是臨床治療肺癌的一線藥物，但其具有較強的毒副作用，且隨著癌細胞耐藥性的增加，使得CDDP的臨床應(yīng)用受到一定限制。細胞惡性增殖是癌細胞的顯著特征之一，因此，尋找一種既能夠抑制肺癌細胞增殖，又能夠降低CDDP劑量的輔助性藥物，具有重要意義。真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物被認為是研發(fā)抗癌藥物的重要來源[3]。布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)是真菌產(chǎn)生的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有抗菌、抗癌等多種活性[4]。研究表明，BFA對前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌等均有抑制增殖和促凋亡作用[5-7]。本課題組前期研究表明，BFA可協(xié)同CDDP抑制肺癌GLC-82細胞生長、誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生，且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途徑中PERK-ATF4和IRE1-XBP1通路的激活有關(guān)[8-10]，但二者的協(xié)同作用，是否也與ERS分子標志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(gloucose regulated protein 94，GRP94)及其主要通路之一轉(zhuǎn)錄活化因子6(activating transcription factor 6，ATF6)通路的激活有關(guān)，尚未闡明。因此，本研究探討了ATF6通路標志性分子ATF6和ATF6B在BFA協(xié)同CDDP抑制肺癌細胞增殖中的作用，為肺癌的臨床治療方案提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人肺癌GLC-82細胞系由中國科學院昆明動物所曹毅研究員惠贈。

BFA購自Cell Signaling Technology公司，順鉑注射液購自山東齊魯制藥公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，PCR引物和dNTP Mix(10mM)購自上海生工生物公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑購自Promega公司，RNAiso TM Plus購自TaKaRa Biotechnology公司，q-RT-PCR試劑盒購自Bio-Rad公司，兔抗人β-actin單抗、鼠抗人GRP94單抗、兔抗人多抗ATF6和ATF6B及二抗均購自Protein-Tech Group公司，CCK8試劑盒購自Solarbio公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱(GOLD-SIM)購自西盟國際公司，酶標儀(Model 680)、PCR儀(CFX Connect TM Optics Module)、電泳儀(PowerPac Basic)及凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR)均購自Bio-Rad公司。

1.2 人肺癌GLC-82細胞培養(yǎng) 人肺癌GLC-82細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含10 %胎牛血清、2.0 g/L NaHCO3、100 μg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素，將細胞置于37 ℃、5 % CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.3 CCK8法檢測GLC-82細胞增殖抑制率 取對數(shù)期細胞，以5×104個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，靜置培養(yǎng)24 h后，分別設(shè)置50 ng/mL BFA組、2 μg/mL CDDP組及50 ng/mL BFA+2 μg/mL CDDP組作為實驗組，同時設(shè)置加入等體積二甲基亞砜的對照組。靜置培養(yǎng)24 h后，按CCK-8試劑盒說明書方法檢測細胞活力，用酶標儀測定450 nm波長處的吸光值(OD值)，對照組細胞增殖抑制率記為0，計算藥物對細胞生長增殖的抑制率。

1.4 檢測 GRP94、ATF6的mRNA水平 藥物處理24 h和48 h后，用RNAiso TM Plus裂解細胞、提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法合成cDNA。PCR引物：β-actin，上游:5′- CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游:5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′；GRP94，上游:5′-CTGGGACTGGGAACTTATGAATG-3′,下游:5′-TCCATATTCGTCAAACAGACCAC-3′；ATF6，上游:5′-TCCTCGGTCAGTGGACTCTTA-3′，下游:5′-CTTGGGCTGAATTGAAGGTTTTG-3′。將cDNA按1∶10稀釋后作為模板，建立反應(yīng)體系：總體積10 μL，包括1 μL cDNA，5 μL Sso Fast Eva Green supermix，0.5 μL 3′引物，0.5 μL 5′引物，3 μL無菌水。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 60 s，95 ℃ 20 s，56 ℃(β-actin)或63.5 ℃(GRP94)或62.4 ℃(ATF6)30 s，40個循環(huán)周期。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△CT方法計算基因的相對表達量。

1.5 檢測 GRP94、ATF6和ATF6B蛋白水平 藥物處理24 h和48 h后，裂解細胞提取其總蛋白質(zhì)，采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量，取一定量的蛋白樣品，進行蛋白變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉、孵育一抗(GRP94 1∶2 000；ATF6 1∶3 000；ATF6B 1∶1 000；β-actin 1∶10 000)、孵育二抗(1∶2 000)、曝光、顯影、晾干、拍照，采用IPP軟件分析條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 BFA 協(xié)同CDDP抑制GLC-82細胞的增殖 CCK8實驗結(jié)果顯示，藥物處理24 h后，BFA組、CDDP組和聯(lián)合用藥組細胞增殖抑制率分別為(28.6±6.8)%、(24.0±9.6)%和(57.1±3.1)%，均顯著高于對照組(P<0.01、P<0.01、P<0.01)，且聯(lián)合用藥組細胞增殖抑制率亦顯著高于BFA組和CDDP組(P<0.01、P<0.01)(見圖1)。

**表示與對照組相比，P<0.01；##表示與聯(lián)合用藥組相比，P<0.01。對照組細胞增殖抑制率記為0。

2.2 BFA 與CDDP對細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP94表達的影響 GRP94是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志性分子之一[11]，本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，BFA 與CDDP聯(lián)合處理24 h后，聯(lián)合用藥組細胞GRP94 mRNA水平上調(diào)(19.9±2.8)倍(P<0.01)(見圖2)，蛋白質(zhì)水平上調(diào)(1.3±0.4)倍(P<0.01)(見圖3)；藥物處理48 h后，聯(lián)合用藥組GRP94 mRNA水平上調(diào)(10.5±0.7)倍(P<0.01，見圖2)，意外的是，蛋白質(zhì)水平下調(diào)(4.5±1.7)倍(P<0.01，見圖3)。

**表示與對照組相比，P<0.01；##表示與聯(lián)合用藥組相比，P<0.01。

*和**表示與對照組相比，P<0.05和P<0.01；#和##表示與聯(lián)合用藥組相比，P<0.05和P<0.01。

2.3 BFA 與CDDP對細胞ATF6表達的影響 ATF6有ATF6和ATF6B兩種亞型，本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，藥物處理24 h后，BFA 與CDDP聯(lián)合用藥組肺癌細胞ATF6 mRNA水平上調(diào)(22.9±4.7)倍(P<0.01)(見圖4)，蛋白質(zhì)水平上調(diào)(6.1±1.8)倍(P<0.01，見圖5)。藥物處理48 h后，聯(lián)合用藥組細胞ATF6 mRNA水平上調(diào)(12.1±1.8)倍(P<0.01，見圖4)，蛋白質(zhì)水平上調(diào)(1.4±0.3)倍(見圖5)。

**表示與對照組相比，P<0.01；#和##表示與聯(lián)合用藥組相比，P<0.05和P<0.01。

2.4 BFA 與CDDP聯(lián)用增強肺癌細胞ATF6B的表達 Western Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，藥物處理24 h后，BFA 與CDDP聯(lián)用后，GLC-82細胞ATF6B蛋白質(zhì)水平上升(5.7±1.8)倍(P<0.01)。但48 h后，其上升趨勢有所下降，聯(lián)合用藥組ATF6B蛋白質(zhì)水平上調(diào)(2.6±0.9)倍(P<0.01，見圖6)。

**表示與對照組相比，P<0.01；#和##表示與聯(lián)合用藥組相比，P<0.05和P<0.01。

**表示與對照組相比，P<0.01；##表示與聯(lián)合用藥組相比，P<0.01。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞中重要的細胞器，主要進行蛋白質(zhì)合成、折疊、聚集等，也是細胞內(nèi)重要的Ca2+儲存場所[12]。ER內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是維持細胞和機體正常生理功能的關(guān)鍵。多種生理性或病理性干擾因素，如缺氧、缺血、營養(yǎng)不良、Ca2+代謝失衡、氧化還原失衡、毒素刺激、炎癥、細胞自噬等均能夠干擾ER的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積累、聚集，最終導(dǎo)致ER穩(wěn)態(tài)平衡的喪失，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了提高ER對蛋白折疊加工的能力，應(yīng)對ERS誘發(fā)的細胞凋亡等不利影響，細胞可通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)來恢復(fù)ER穩(wěn)態(tài)及正常功能，從而促進細胞存活[13]。目前已知的UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程主要是由ER的三種跨膜蛋白所啟動，即蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor 6，ATF6)及肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme-1，IRE1)[14]。正常情況下，PERK、ATF6和IRE1與ER的分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)緊密結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體，均處于無活性狀態(tài)；當發(fā)生ERS時，ER腔中積累的未折疊或錯誤折疊蛋白優(yōu)先與GRP78結(jié)合，導(dǎo)致3種跨膜蛋白與GRP78發(fā)生解離而被激活，從而觸發(fā)UPR信號通路，并影響下游分子及相關(guān)基因的表達[15]。研究表明，ERS與UPR在很多腫瘤(如肝癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌等)的發(fā)生、發(fā)展中具有十分重要的作用，對腫瘤細胞存活、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成和腫瘤細胞凋亡等方面[16-17]。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose-regulated protein 94，GRP94)是熱休克蛋白90(heat shock protein，HSP90)家族的成員之一，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，是一種高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐度蛋白和駐留糖蛋白，與HSP90具有50%的同源性[11]。GRP94作為分子伴侶，一方面參與到蛋白質(zhì)的折疊、加工、轉(zhuǎn)運和分泌過程，另一方面參與了腫瘤特異性抗原的提呈，以啟動細胞特異性免疫反應(yīng)。與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、GRP78蛋白及鈣網(wǎng)織蛋白不同，GRP94能夠與Ca2+結(jié)合，參與寡聚體的組裝、分解，抑制錯誤蛋白質(zhì)的分泌過程。研究證實，GRP94與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[18]。GRP94的高表達能夠增加肺癌NCI-H460細胞對CDDP的化療敏感性[19]。本研究結(jié)果顯示，BFA與CDDP協(xié)同可顯著抑制肺癌GLC-82細胞的增殖作用，在聯(lián)合用藥24 h時，BFA協(xié)同CDDP增加了細胞GRP94分子的表達水平，從而增加了二者抑制肺癌細胞增殖的能力；而在聯(lián)合用藥48 h時，細胞已發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷，細胞對外界的應(yīng)激能力減弱，導(dǎo)致諸如應(yīng)激等伴侶蛋白，如GRP94等水平表達受到一定程度的抑制。這與許多報道一致，即適當?shù)腅RS促進細胞存活，而過度的ERS則抑制細胞生長增殖[20]。

ATF6位于ER膜的胞質(zhì)側(cè)，在哺乳動物細胞中具有ATF6(ATF6α)和ATFB(ATF6β) 兩種亞型。當ERS發(fā)生時，ATF6與GRP78解離，與衣被蛋白Ⅱ(coat protein，COPⅡ)結(jié)合后移位至高爾基體中，依次被位點1蛋白酶(S1P)和位點2蛋白酶(S2P)水解，釋放只含有N末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的p50活性片段，其移位至胞核內(nèi)與ERS反應(yīng)元件(endoplasmic reticulum stress element，ERSE)相互結(jié)合，激活ERS相關(guān)分子如GRP94、XBP1、ERP72和CHOP 等的轉(zhuǎn)錄[21]，增加ER的蛋白折疊容量。ATF6在UPR中具有十分重要的作用，被認為是ERS的一個重要靶點[22]。已有研究表明，在結(jié)腸癌組織中ATF6的表達水平顯著下調(diào)，表明其在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用[23]。當腎小球足細胞內(nèi)ATF6的表達被沉默后，棕櫚酸對足細胞增殖的抑制作用明顯減弱。本研究結(jié)果顯示，正常對照組肺癌GLC-82細胞處于低應(yīng)激狀態(tài)，ATF6和ATF6B的表達水平較低，與上述研究結(jié)果一致；而經(jīng)BFA與CDDP聯(lián)合處理后，細胞應(yīng)激水平升高， ATF6通路被激活，表現(xiàn)為ATF6和ATF6B的表達水平上調(diào)。因此，BFA協(xié)同增強CDDP抑制GLC-82細胞增殖的機制之一可能是BFA與CDDP聯(lián)合用藥促進細胞ATF6和ATF6B的表達水平上調(diào)，耗竭了GRP94等維護細胞穩(wěn)態(tài)的分子，細胞無法通過ERS維持穩(wěn)態(tài)、停止增殖，最終死亡。

綜上所述，BFA協(xié)同增強CDDP抑制肺癌GLC-82細胞增殖的作用與ATF6通路和GRP94分子的激活密切相關(guān)，為肺癌的分子靶向治療和臨床治療方案提供了新的探索。