剪切應(yīng)力對(duì)晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)及分布的影響

張 怡，王 信，成 敏，黃厚今

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨科，貴州 遵義 563099；3.濰坊醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，山東 濰坊 261053)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS) 等心腦血管疾病的發(fā)生往往是由于血管內(nèi)皮損傷和修復(fù)失衡引起的[1]。而內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs) 在某些藥物刺激、血管損傷以及缺血的情況下，能從骨髓動(dòng)員至外周血，分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，從而參與到血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)[2-3]。因此促進(jìn)EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，加速對(duì)受損血管內(nèi)皮的修復(fù)是一種新的有效防治AS的重要策略。

本課題組前期研究表明，剪切應(yīng)力(12 dyne/cm2)可有效促進(jìn)EPCs分化，特別是作用3 h時(shí)，能顯著上調(diào)內(nèi)皮分化標(biāo)志分子CD31、vWF mRNA的表達(dá)，加速頸動(dòng)脈損傷模型大鼠受損內(nèi)皮的修復(fù)[4]。并且在這一過程中細(xì)胞骨架蛋白起到了重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，然而剪切應(yīng)力是否直接調(diào)控EPCs細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)及分布，迄今未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(Invitrogen)；梯度離心液(Histopaque?-1083,Sigma)；纖維粘連蛋白(fibronectin,Fn,Roche)；M199(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青)；Dil-ac-LDL(Molecular Probe)；FITC-UEA-1 (Sigma)；FAK的兔抗大鼠一抗(Abcam)；talin及paxillin的小鼠抗大鼠一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、β-action的兔抗大鼠單抗IgG和HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG (Santa cruz)；多聚甲醛(天津科密歐)；150～175 g雄性SD大鼠購(gòu)自解放軍第八十九醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈臺(tái)(AIRTECH，Haier)；CO2孵箱和離心機(jī)(Heraeus)；倒置熒光顯微鏡(DMI4000B，Leica)；倒置相差顯微鏡(Olympus)；流室系統(tǒng)裝置包括蠕動(dòng)泵及管道(Cole-parmer)、儲(chǔ)液瓶及流槽(由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室提供)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BioTek)；電泳儀(北京君意)；半干轉(zhuǎn)儀及濕轉(zhuǎn)儀(Amersham biosciences)。

1.3 EPCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 按本課題組建立的方法[5]，采用梯度離心法分離大鼠骨髓單核細(xì)胞，用完全M199(含15%胎牛血清、1%雙抗、10 ng/mL VEGF、5 ng/mL bFGF)制成細(xì)胞懸液，種植于FN打底的玻璃培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃恒溫孵箱，一周后換液。采用預(yù)熱的PBS輕輕將未貼壁的細(xì)胞洗干凈，換入新鮮預(yù)熱的完全M199培養(yǎng)基。隨后每隔3 d換一次完全培養(yǎng)基，待培養(yǎng)瓶底部鋪滿細(xì)胞時(shí)進(jìn)行傳代，在2代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 μg/mL 的Dil-ac-LDL，避光孵育1 h后采用2%多聚甲醛固定15 min，再采用PBS浸洗，隨后再避光加入10 μg/mL 的FITC-UEA-1孵育1 h，最后PBS浸洗干凈后在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為兩組：①剪切應(yīng)力干預(yù)組：模擬生理狀態(tài)下大動(dòng)脈系統(tǒng)所受層流剪切應(yīng)力大小，給予12 dyne/cm2的力學(xué)負(fù)荷[6]，處理時(shí)間為3 h；②靜止對(duì)照組：將細(xì)胞爬片放入同一細(xì)胞培養(yǎng)箱中，不加任何其他處理。

1.5 Western Blot檢測(cè)FAK、paxillin和talin細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)量 取剪切應(yīng)力干預(yù)組和靜止對(duì)照組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量預(yù)處理的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。濕轉(zhuǎn)(400 mA、2 h)，一抗(1∶200)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶500)室溫孵育1 h， ECL顯色，曝光。將膠片用掃描儀進(jìn)行掃描，用Kodak Digital Science 1D定量條帶灰度值，以自身β-action作為內(nèi)參。

1.6 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取剪切應(yīng)力干預(yù)組和靜止對(duì)照組爬片，用新鮮過濾的4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.05%吐溫20室溫破膜5 min×3次，封閉液(含10%羊血清、1%BSA)室溫封閉30 min。FAK實(shí)驗(yàn)條件：一抗(1∶50)濕盒4 ℃過夜，PE標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶50)37 ℃避光孵育1 h。Talin及Paxillin實(shí)驗(yàn)條件：一抗(1∶40)濕盒4 ℃過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶100)37 ℃避光孵育1 h。最后抗淬滅封片劑封片，熒光倒置顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的培養(yǎng)與鑒定 從大鼠骨髓中分離出來的單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，1周內(nèi)大多貼壁，逐漸開始伸展成梭形。2周開始形成細(xì)胞集落，中間有圓形細(xì)胞群，而周邊則不斷生成梭形細(xì)胞，生長(zhǎng)為集簇樣結(jié)構(gòu)(見圖1A)。3周左右，細(xì)胞可鋪滿瓶底的80%，此時(shí)多以梭形細(xì)胞為主，也有少量多角形細(xì)胞(見圖1B)。細(xì)胞進(jìn)行FITC-UEA-1(見圖1C)及Dil-ac-LDL(見圖1D)染色鑒定，(89.3±6.2)%的細(xì)胞為雙染陽性(見圖1E)。

A：培養(yǎng)2周后的細(xì)胞集落；B：第3周細(xì)胞形態(tài)；C-E：同一視野下雙吞噬的EPCs。

**：shear stress干預(yù)組與static對(duì)照組相比較，P<0.01。

2.3 流體剪切應(yīng)力對(duì)FAK、talin和paxillin細(xì)胞骨架蛋白胞內(nèi)分布的影響 靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，F(xiàn)AK、talin和paxillin三種細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)豐富，散在分布于胞漿中。12 dyne/cm2剪切應(yīng)力作用3 h以后，talin和paxillin蛋白的熒光強(qiáng)度變?nèi)?，但FAK的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，沿剪切應(yīng)力作用方向聚集成束狀延伸至細(xì)胞邊緣(見圖3)。

圖3 剪切應(yīng)力對(duì)FAK,talin和 paxillin在EPCs內(nèi)分布的影響(×400)

3 討論

鑒于EPC具有修復(fù)內(nèi)皮損傷的功能，找到理想的方法上調(diào)其活性，對(duì)于以EPC為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法修復(fù)AS等疾病的內(nèi)皮損傷意義重大。目前國(guó)內(nèi)外多關(guān)注于采用功能基因轉(zhuǎn)染、生長(zhǎng)因子VEGF等刺激以及藥物干預(yù)等方法[7-8]，增強(qiáng)EPCs的功能活性，但由此產(chǎn)生的藥物價(jià)格高昂，并且副作用較大，使得臨床應(yīng)用受到一定的限制。

由于內(nèi)皮祖細(xì)胞在體內(nèi)所處的特殊位置，很明顯它還受到流體力學(xué)因素的影響。中山大學(xué)陶軍課題組就曾經(jīng)提出“體外切應(yīng)力處理及通過運(yùn)動(dòng)提高在體血流切應(yīng)力，可作為增強(qiáng)EPC修復(fù)內(nèi)皮損傷的重要手段”[9]。Yamamoto等[10]的研究也表明，組織液或血液流動(dòng)產(chǎn)生的切應(yīng)力可加速EPC的分化和增殖，從而促進(jìn)毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)的形成。但剪切應(yīng)力這種“力學(xué)刺激”是如何調(diào)控EPC分化的，即其跨膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不十分明確。

細(xì)胞對(duì)外力的應(yīng)答，涉及到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。在此過程中，切應(yīng)力這種胞外力學(xué)的物理信號(hào)首先需要被轉(zhuǎn)化成化學(xué)信號(hào)，繼而開啟后續(xù)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。FAK、talin及paxillin是ECM-整合素-CSK系統(tǒng)中很重要的信號(hào)分子，黏著斑激酶(FAK)集中了ECM信號(hào)和可溶性細(xì)胞因子信號(hào)，是其重要的交匯點(diǎn)，且其是一種非受體型酪氨酸激酶，在整合素、細(xì)胞骨架和細(xì)胞因子受體信號(hào)的鏈接中發(fā)揮著非常重要的作用[11]。整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附和細(xì)胞因子受體的刺激均可以激活黏著斑激酶，繼而調(diào)控細(xì)胞增生、存活、分化、移行以及細(xì)胞骨架的重組[12]。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，剪切應(yīng)力可以通過PI3K介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞產(chǎn)生作用[13]，而來自其他細(xì)胞模型的研究表明，PI3K的激活需要FAK的活化[14]。FAK的激活又依賴于粘著斑的形成，而粘著斑蛋白包括兩組：調(diào)節(jié)蛋白(paxillin等)和結(jié)構(gòu)蛋白(talin等)[15]。本實(shí)驗(yàn)在剪切應(yīng)力促使EPC向內(nèi)皮分化的過程中，觀察到FAK、talin和paxillin蛋白表達(dá)量發(fā)生變化，且FAK蛋白的表達(dá)位置也發(fā)生改變，實(shí)驗(yàn)提示，F(xiàn)AK引導(dǎo)的信號(hào)途徑與EPC內(nèi)皮分化緊密相連。故將FAK作為內(nèi)皮損傷的治療靶點(diǎn)也將存在巨大潛力。

本課題揭示12 dyne/cm2的剪切應(yīng)力可以促進(jìn)大鼠骨髓來源的EPCs向內(nèi)皮分化，且在此過程中，F(xiàn)AK、talin和paxillin三個(gè)蛋白的表達(dá)量和表達(dá)位置有所改變。據(jù)此提出，細(xì)胞骨架蛋白FAK、paxillin和talin很可能是內(nèi)皮祖細(xì)胞感知細(xì)胞外的力學(xué)信號(hào)并將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)信號(hào)的橋梁，剪切應(yīng)力有可能就是通過該橋梁從而實(shí)現(xiàn)跨膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控EPCs分化。此為EPC應(yīng)用于臨床及血管損傷的修復(fù)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。