廣東口岸結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群分子 流行病學(xué)特征分析

吳培豐 溫穎 陳嘉 高穎龍 白靜 王向陽 吳健

傳染性肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)經(jīng)我國口岸輸入和輸出，是高危險度的公共衛(wèi)生風(fēng)險事件。近年來，由于耐藥PTB，尤其是耐多藥(multidrug resistance，MDR)PTB的出現(xiàn)，更加劇了其防治難度。出入境PTB患者是結(jié)核病跨境傳播的傳染源，亦是我國口岸重點監(jiān)管的對象。非洲、東南亞等結(jié)核病及耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)地區(qū)[1]和泛珠三角地區(qū)的流動人口是廣東口岸出入境人群的主要組成部分。因此，廣東口岸存在一定的結(jié)核病及耐藥結(jié)核病傳播風(fēng)險。在口岸結(jié)核病傳統(tǒng)流行病學(xué)監(jiān)測[2-4]的基礎(chǔ)之上，對其分子流行病學(xué)特征及傳播規(guī)律進(jìn)行深入探究，將為我國口岸結(jié)核病防控提供更加強(qiáng)有力的技術(shù)支持。因此，本研究采用集簡便、快速、自動化判讀、準(zhǔn)確率高、特異度好等優(yōu)點[5]于一體的熔解曲線間隔區(qū)寡核苷酸分型(melting curve spoligotyping，McSpoligotyping)技術(shù)，對廣東口岸558株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)進(jìn)行基因分型，以期了解廣東口岸MTBC主要流行菌株及輸入性菌株的分子流行病學(xué)特征，為廣東口岸未來實施更加精準(zhǔn)的結(jié)核病防控[6]提供參考依據(jù)。

資料和方法

一、樣本與資料

1.DNA樣本：2009年7月至2016年11月，廣東口岸出入境健康體檢人群經(jīng)臨床與影像學(xué)篩查后的疑似PTB患者，連續(xù)3 d留取晨痰，每份樣本經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉法消化處理后，分別接種于BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)基和酸性改良羅氏培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株經(jīng)Gene Probe法鑒定為MTBC共558株，經(jīng)超聲波+熱裂解法提取DNA，DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.一般資料：所有臨床分離株的相關(guān)流行病學(xué)資料及實驗室檢測結(jié)果來自本實驗室FreezerPro?生物樣本智能管理系統(tǒng)。558株MTBC的來源地區(qū)分別為廣東402株、廣西34株、湖南11株、遼寧10株、河南8株、吉林8株、湖北8株、貴州8株、江西7株、四川7株、重慶7株、海南5株、黑龍江4株、山東4株、陜西3株、江蘇3株、浙江3株、福建3株、中國香港2株、云南2株、新疆及天津各1株；東南亞及非洲各6株，東亞2株，中亞、南亞及大洋洲各1株。MTBC的藥物敏感性試驗(drug-susceptibility testing，DST)采用液體比例法(BD BACTECTMMGITTM960 system)進(jìn)行，包括鏈霉素(streptomycin，Sm)、異煙肼(isoniazid，H)、利福平(rifampicin，R)、乙胺丁醇(ethambutol，E)和吡嗪酰胺(pyrazinamide，Z)等5種藥物；558株MTBC中有1株因菌株老化而無DST結(jié)果。

二、方法

1.主要儀器與試劑：SLAN-96P實時熒光定量PCR儀、結(jié)核分枝桿菌McSpoligotyping分型檢測試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)。

2.基因分型：采用McSpoligotyping技術(shù)進(jìn)行檢測，實驗操作按試劑盒說明書進(jìn)行，以標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv DNA為陽性對照，雙蒸水為陰性對照，分型結(jié)果由軟件自動判讀并以國際通用的43位二進(jìn)制碼格式輸出。

3.結(jié)果分析：將分型結(jié)果與SITVITWEB數(shù)據(jù)庫[7]進(jìn)行比對，獲取間隔區(qū)寡核苷酸國際型別(spoligotype international type，SIT)編號及其家族分類，參照文獻(xiàn)[8-10]獲取其家系分類，聚類分析采用BioNumerics 7.6進(jìn)行。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間耐藥率的比較采用χ2檢驗，所有檢驗均為雙側(cè)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基因型、基因家族和家系

558株MTBC共分為107種基因型，其中66種在SITVITWEB數(shù)據(jù)庫中已存在，41種為新基因型，輸入性和輸出性MTBC均有檢出的基因型為SIT1、SIT19和SIT42；涵蓋8種已知基因家族，北京、MANU、T、Haarlem(H)、拉丁美洲和地中海(Latin American and Mediterranean，LAM)、X、East African Indian(EAI)和Africanum(AFRI)家族分別占菌株總數(shù)的69.89%(390/558)、0.54%(3/558)、9.86%(55/558)、4.12%(23/558)、1.79%(10/558)、0.18%(1/558)、2.51%(14/558)和0.18%(1/558)；涵蓋4種家系，其中家系2和家系4共占菌株總數(shù)的86.38%(482/558)(表1)。

二、成簇性分析

558株MTBC歸類于29個簇(2～366株)中，總體可分為北京家族和非北京家族兩大簇。6個主要流行簇分別為SIT1(65.59%，366/558)、SIT53(2.69%，15/558)、SIT52(2.33%，13/558)、SIT50(2.33%，13/558)、SIT190(1.43%，8/558)和SIT19(1.08%，6/558)，分屬于典型北京、T1、T2、H3、非典型北京和EAI2-Manilla家族(圖1)。

表1 558株MTBC的基因分型結(jié)果

注a：無家系分類；UN：未定義的基因家族，其余為國際通用的基因家族；b：52個基因型中有11個有SIT編號，41個為新基因型；c：558株MTBC 中，1株AFRI_3為非洲分枝桿菌，UN中包含11株未知菌型的MTBC，其余546株均為結(jié)核分枝桿菌

圖1 558株MTBC的最小生成樹圖

三、輸入性MTBC分析

2009—2016年檢出的17株輸入性MTBC，分屬于北京、LAM、EAI、T、AFRI及未定義的基因家族。其中，新基因型占23.53%(4/17)。入境患者中，女性占64.71%(11/17)，平均年齡(26.71±5.92)歲，留學(xué)生占58.82%(10/17)，來自非洲和東南亞的患者占70.59%(12/17)(表2)。

四、北京家族菌株與耐藥性的關(guān)系

557株MTBC的耐藥率為26.21%(146/557)，MDR率為5.75%(32/557)，Sm、H、R、E及Z的耐藥率分別為13.64%(76/557)、18.13%(101/557)、7.54%(42/557)、3.41%(19/557)、6.46%(36/557)。北京家族菌株的耐藥率為27.25%(106/389)，非北京家族菌株的耐藥率為23.81%(40/168)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.72，P=0.40)(表3)。典型北京家族菌株的耐藥率為26.03%(95/365)，非典型北京家族菌株的耐藥率為45.83%(11/24)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.46，P=0.03)(表4)。

討 論

廣東口岸MTBC涵蓋SITVITWEB數(shù)據(jù)庫的66種已知基因型、41種新基因型，具有一定的基因多態(tài)性；主要流行菌株為家系2和家系4，占菌株總數(shù)的86.38%，在輸入性和輸出性MTBC中均有檢出。本研究檢出的家系2由北京和Manu_ancestor家族組成。文獻(xiàn)報道顯示，北京家族以高毒力、易復(fù)發(fā)及不易治愈等特點而造成廣泛傳播[8，11-12]。北京家族在我國高度流行[13-19]，也是廣東口岸的優(yōu)勢流行菌株。MANU家族主要在印度等地區(qū)出現(xiàn)，我國部分地區(qū)亦可見少量檢出[15，18-21]，本研究發(fā)現(xiàn)的Manu_ancestor家族來自廣東和廣西。家系4含T、H、LAM和X家族，主要流行于美洲、歐洲、北非和中東等地區(qū)[8]，在國內(nèi)亦較為常見[18-21]。家系1含 EAI家族，主要流行于東南亞、南印度及東非等地區(qū)[8]，國內(nèi)少有報道[19，21]。本研究中EAI家族來自我國廣東、廣西、海南和菲律賓。上述情況表明北京家族和家系4在廣東口岸和國內(nèi)較為活躍，MANU家族和家系1具有地方流行特性。

表2 17株輸入性MTBC的基因分型結(jié)果及患者的人口學(xué)特征

注new：在SITVITWEB數(shù)據(jù)庫中不存在；UN：未定義的基因家族，其余為國際通用的基因家族

表3 不同基因家族MTBC與耐藥性的關(guān)系

注“-”：菌株數(shù)量太少而不宜進(jìn)行統(tǒng)計分析

表4 不同亞型北京家族MTBC與耐藥性的關(guān)系

注“-”：菌株數(shù)量太少而不宜進(jìn)行統(tǒng)計分析

Yang等[22]的研究表明，感染北京家族菌株是導(dǎo)致近期傳播的危險因素。廣東口岸MTBC最大流行簇SIT1屬北京家族，與云南和廣東報道的結(jié)果一致[18，23]，第5大流行簇SIT190也屬北京家族。這些在一定程度上反映北京家族菌株可能具有更強(qiáng)的毒力和傳播能力。上述研究提示，廣東口岸存在一定的結(jié)核病近期傳播風(fēng)險，加強(qiáng)對成簇菌株的監(jiān)測研究十分必要。

本研究中，入境患者有70.59%來自非洲和東南亞地區(qū)，并以青壯年、留學(xué)生為主。輸入性MTBC包含北京、LAM、EAI、T及AFRI等來源地區(qū)流行的基因家族，其中1株非洲分枝桿菌(AFRI_3家族)來源于2016年入境的一位非洲留學(xué)生，為口岸首次報道。研究表明，該家族大多發(fā)現(xiàn)于非洲[9，24]，與本研究結(jié)果一致。此外，本研究中有61株MTBC屬未定義的基因家族(含47株新基因型)，其中50株的33、34位點均缺失，為結(jié)核分枝桿菌，其余11株因檢測出33和/或34位點而未能確定其具體菌型，考慮與MTBC表達(dá)基因發(fā)生突變有關(guān)[25]，這些未知情況有待進(jìn)一步采用全基因組測序等方法進(jìn)行探究。隨著我國“一帶一路”戰(zhàn)略的加快實施，人、動物及商品等國際間交流更加頻繁，若不加強(qiáng)對輸入性和新基因型MTBC的監(jiān)控，則其傳播可能導(dǎo)致各型MTBC的混合感染，繼而產(chǎn)生新的適應(yīng)力或毒力更強(qiáng)的MTBC在人畜間傳播。

本研究顯示，北京家族菌株與非北京家族菌株相比，在耐藥性上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與青海、寧夏、重慶及北京[19-20,26-27]的研究結(jié)果一致，而與中國大陸、中國臺灣及北印度[28-30]等地區(qū)的報道不同。這說明，盡管北京家族分布廣泛，但在不同地區(qū)、不同人群中表現(xiàn)出了一定的耐藥性差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，非典型北京家族菌株的耐藥率顯著高于典型北京家族菌株。這提示不同亞型北京家族菌株的耐藥潛力存在差異?；蚍中蜋z測可為臨床診療提供一定的參考價值，對不同亞型北京家族進(jìn)行獨立研究更加符合精準(zhǔn)診斷的要求。

志謝廣東省疾病預(yù)防控制中心病原微生物檢驗所李柏生老師對本研究給予了科學(xué)指導(dǎo)