熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌 耐藥基因的結(jié)果分析

劉艷 古麗比克·木拉提 瑪力亞木·阿布力提甫 易星 李君蓮 師永歡 劉天劍

結(jié)核病是全球重大傳染病之一，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。而耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的產(chǎn)生，使結(jié)核病防治形勢更加嚴(yán)峻[2]。MDR-TB即至少同時對異煙肼(INH)和利福平(RFP)產(chǎn)生耐藥的結(jié)核病[3]，其治療成本高、周期長、治愈率低，早診斷、早治療是實現(xiàn)耐藥結(jié)核病有效防控的關(guān)鍵所在[4-6]。目前，常用的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)普遍存在耗時長、操作復(fù)雜、標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一等缺點；因此，無論臨床還是疾控領(lǐng)域都迫切需要一種快速而準(zhǔn)確的結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測方法[4-8]。本研究應(yīng)用探針熒光PCR熔解曲線法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌DNA鑒定和INH、RFP耐藥突變的快速檢測，并與傳統(tǒng)的BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)液體培養(yǎng)和液體藥敏試驗結(jié)果相比較，以評價該方法在快速診斷結(jié)核病和MDR-TB中的應(yīng)用價值，并為相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

一、 標(biāo)本來源

收集2015年9月至2016年12月新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院976例疑似結(jié)核病住院患者的痰液標(biāo)本。

二、 試劑與儀器

RFP、INH購于美國Sigma-Aldrich公司； MGIT 960液體培養(yǎng)設(shè)備及培養(yǎng)管購于美國BD公司；4% NaOH由購于國藥集團(tuán)的分析純氫氧化鈉粉末以雙蒸水自行配制；Lab-Aid 824全自動核酸提取儀及配套結(jié)核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑購于廈門致善生物科技股份有限公司；Bio-Rad CFX96實時熒光PCR儀購于美國伯樂公司。

三、 液體培養(yǎng)與藥敏試驗

按照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》進(jìn)行MGIT 960液體培養(yǎng)(以下簡稱：液體培養(yǎng))。用移液槍吸取2～5 ml痰液至50 ml離心管中，加入1～2倍體積的4% NaOH溶液，振蕩15～30 s，直至痰標(biāo)本充分液化；隨后加入磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)至離心管45 ml標(biāo)記處，顛倒離心管，充分混勻， 在8～10 ℃條件下， 3000×g離心15 min，棄去上清，加入無菌磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)至終體積為2.5 ml，重懸沉淀，吸取0.5 ml懸浮液于BBL MGIT 960培養(yǎng)管中，擰緊管蓋并充分混勻；最后將MGIT 960培養(yǎng)管放入儀器內(nèi)進(jìn)行孵育， MGIT 960熒光強(qiáng)度記憶探測器每隔60 min連續(xù)測定培養(yǎng)管內(nèi)的熒光強(qiáng)度，判斷管內(nèi)分枝桿菌的生長情況。若出現(xiàn)陽性標(biāo)本，儀器紅色指示燈立即閃亮，同時有報警提示音。按儀器操作步驟取出陽性培養(yǎng)管并自動打印出結(jié)果。

培養(yǎng)結(jié)果陽性者將其培養(yǎng)物采用MGIT 960進(jìn)行 RFP、INH液體藥敏試驗。在MGIT 960系統(tǒng)報告陽性之后的5 d之內(nèi)必須完成藥敏試驗接種，先將3管BBL MGIT 960培養(yǎng)管分別標(biāo)記為RFP、INH和GC(空白對照)，并加入0.8 ml配套的增菌劑；將100 μl RFP(83 μg/ml)或INH(8.3 μg/ml)加入對應(yīng)的培養(yǎng)管中，取0.1 ml菌懸液用滅菌生理鹽水按照1∶100進(jìn)行稀釋，吸取0.5 ml于GC培養(yǎng)管中，同時吸取0.5 ml未稀釋的菌懸液于RFP和INH培養(yǎng)管中，蓋緊管蓋，上下顛倒3～4次，將培養(yǎng)管放入MGIT 960培養(yǎng)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)分枝桿菌的生長情況對比而判斷該藥物的敏感性。

四、 熒光PCR熔解曲線法檢測RFP、INH耐藥突變

采用結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒和結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測試劑盒進(jìn)行檢測。利福平耐藥突變檢測試劑盒檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群rpoB基因507～533共27個氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)(81 bp，利福平耐藥決定區(qū))的突變情況；異煙肼耐藥突變檢測試劑盒檢測ahpC啟動子(-44至-30及-15～3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17至-8位點)，以及katG315密碼子的突變情況，以進(jìn)行耐藥篩選。

樣本處理及提?。禾狄簶颖綝NA提取前需進(jìn)行液化，將痰液標(biāo)本加到50 ml帶螺旋蓋子的試管中，加入2倍體積的4% NaOH溶液，擰緊螺旋蓋并振蕩混勻30 s，然后室溫放置15 min，期間震蕩數(shù)次，以保證痰液能完全液化。液化后采用Lab-Aid 824結(jié)核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑進(jìn)行提取。

PCR反應(yīng)程序設(shè)置：(1)利福平程序。 UNG酶處理：50 ℃，2 min，1個循環(huán)；預(yù)變性：95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；降落PCR循環(huán)：95 ℃ 15 s，70 ℃ 20 s(每個循環(huán)下降1 ℃)，76 ℃ 25 s，13個循環(huán)； PCR循環(huán)：95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，76 ℃ 25 s，42個循環(huán)；熔解分析： 95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，45～85 ℃(設(shè)置在此階段每1 ℃采集FAM 和TET 通道熒光信號)，1個循環(huán)。(2)異煙肼程序。UNG處理：50 ℃ 2 min，1個循環(huán)；預(yù)變性：95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；降落PCR循環(huán)：95 ℃ 10 s，71 ℃ 25 s(每個循環(huán)下降1 ℃)，75 ℃ 30 s，10個循環(huán)； PCR循環(huán)： 95 ℃ 10 s，61 ℃ 25 s，75 ℃ 25 s，45個循環(huán)；熔解分析： 95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，40～80 ℃(設(shè)置在此階段每1 ℃采集FAM 和TET 通道熒光信號)，1個循環(huán)。

每個標(biāo)本有2個反應(yīng)管，同時檢測 FAM和TET熒光通道信號。根據(jù)說明書進(jìn)行結(jié)果判讀：當(dāng)標(biāo)本在4個熒光通道的熔解溫度(Tm值)均與陽性對照的Tm值一致(誤差不超過 ±1 ℃) 時判定為野生型，此時對利福平或異煙肼敏感； 當(dāng)4 個通道任一通道中標(biāo)本的Tm值低于陽性對照 2 ℃及以上時(△Tm≥ 2 ℃) 判定為突變型，此時該樣本對利福平或異煙肼耐藥。

五、 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗結(jié)果間的比較采用敏感度、特異度、符合率、Kappa值(較差：0.00～0.40；中等：0.41～0.60；較高：0.61～0.80；極好：0.81～1.00)等表示，以評價熒光PCR熔解曲線法的診斷應(yīng)用價值。

結(jié) 果

一、診斷效能比較

本研究共收集痰標(biāo)本976份，熒光PCR熔解曲線法對結(jié)核分枝桿菌DNA鑒定結(jié)果顯示有184份標(biāo)本檢測結(jié)果為陽性，792份標(biāo)本為陰性。MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果顯示169份標(biāo)本為陽性，807份標(biāo)本為陰性；采用對硝基苯甲酸(PNB)進(jìn)行菌種鑒定，液體培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中有11例為NTM，因此，最終確認(rèn)為培養(yǎng)陽性的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本為158例，陰性樣本有818例。兩種檢測方法共同檢測結(jié)果為陽性的標(biāo)本有135份，共同檢測為陰性的標(biāo)本為792份。以液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度為85.44%，特異度為94.01%，Kappa值為0.75，符合率為92.62%，陽性預(yù)測值為73.37%，陰性預(yù)測值為97.10%，具體見表1。

二、異煙肼耐藥檢測結(jié)果

熒光PCR熔解曲線法和液體培養(yǎng)法均檢測為結(jié)核分枝桿菌陽性的135份標(biāo)本中，經(jīng)MGIT 960藥敏試驗檢測發(fā)現(xiàn)有24份標(biāo)本對異煙肼耐藥，熒光PCR熔解曲線法耐藥突變檢測結(jié)果顯示26份標(biāo)本對異煙肼耐藥。以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測異煙肼是否耐藥的敏感度為83.33%，特異度為94.59%，符合率為92.59%，Kappa值為0.76，陽性預(yù)測值為76.92%，陰性預(yù)測值為96.33%，具體見表2。

三、利福平耐藥檢測結(jié)果

熒光PCR熔解曲線法和液體培養(yǎng)法共同檢測結(jié)核分枝桿菌陽性的135份標(biāo)本中，經(jīng)MGIT 960藥敏試驗檢測發(fā)現(xiàn)有24份標(biāo)本對利福平耐藥，熒光PCR熔解曲線法耐藥突變檢測結(jié)果顯示28份標(biāo)本對利福平耐藥。以藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測利福平耐藥的敏感度為95.83%，特異度為95.50%，符合率為95.56%，Kappa值為0.86，陽性預(yù)測值為82.14%，陰性預(yù)測值為99.07%，具體見表3。

表1 976份痰標(biāo)本熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960液體培養(yǎng)檢測結(jié)果

注敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=d/(b+d)×100%；符合率=(真陽性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽性數(shù)+假陰性數(shù))=(a+d)/(a+b+c+d)；陽性預(yù)測值=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=d/(c+d)×100%

表2 135份痰標(biāo)本熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960藥敏試驗異煙肼耐藥檢測結(jié)果

注敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=d/(b+d)×100%；符合率=(真陽性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽性數(shù)+假陰性數(shù))=(a+d)/(a+b+c+d)；陽性預(yù)測值=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=d/(c+d)×100%

表3 135份痰標(biāo)本熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960藥敏試驗利福平耐藥檢測結(jié)果

注敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=d/(b+d)×100%；符合率=(真陽性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽性數(shù)+假陰性數(shù))=(a+d)/(a+b+c+d)；陽性預(yù)測值=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=d/(c+d)×100%

討 論

據(jù)WHO報道，我國是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[3]，由于人口流動性增大和艾滋病流行趨勢的上升，其防治形勢更加嚴(yán)峻。而目前傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷和耐藥檢測方法已經(jīng)無法滿足耐藥結(jié)核病早發(fā)現(xiàn)、早治療的迫切需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生結(jié)核分枝桿菌耐藥的分子機(jī)制與基因突變有關(guān)，不同的基因突變使得結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生不同的藥物耐受性[9]。目前分子水平上的診斷方法主要有線性探針反向雜交法、基因芯片法、實時熒光PCR法和熒光PCR熔解曲線法等，為輔助診斷起到積極的促進(jìn)作用[7,10-12]。熒光PCR熔解曲線法將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和熒光探針熔解曲線分析法相結(jié)合，具有快速、準(zhǔn)確、簡便、高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，可同時對結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼相關(guān)耐藥突變基因進(jìn)行快速檢測，特別適用于臨床上大批量樣本篩查。

本研究顯示，與MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果相比，熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度及特異度較好，熒光PCR熔解曲線法總體檢出的陽性率較高。一方面可能因為MGIT 960液體培養(yǎng)時僅限于檢測標(biāo)本中的活菌；而熒光PCR熔解曲線法因檢測的是結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA，因此，即使結(jié)核分枝桿菌已經(jīng)死亡，也可獲得陽性檢測結(jié)果。另一方面也可能與實驗人員的操作規(guī)范性、交叉污染等問題有關(guān)[13-14]。不同研究顯示，采用分子生物方法對痰液中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測，相對于培養(yǎng)法其特異度多數(shù)為90%以上，敏感度為66.4%～100%，多數(shù)在90%左右[15-18]。與本次研究相近，細(xì)微的差別可能與入組的樣本、培養(yǎng)方法、樣本數(shù)量等因素有關(guān)。

在對異煙肼的耐藥突變檢測結(jié)果中顯示，熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960藥敏試驗相比，特異度達(dá)到94%以上，敏感度為83.33%，相比特異度略低，可能與試劑盒尚無法覆蓋所有耐藥突變位點以及少量存在的低水平異質(zhì)性耐藥有關(guān)[7，19]。熒光PCR熔解曲線法檢測利福平耐藥突變的敏感度和特異度與MGIT 960藥敏試驗相比具有較高的一致性，均達(dá)到95%以上。張國欽等[20]及黃玉平等[21]分別采用線性探針技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行耐藥檢測研究，其中對異煙肼耐藥檢測的敏感度分別為68.7%和80.4%，低于本次研究。可能與熒光PCR熔解曲線法多覆蓋的ahpC啟動子區(qū)有關(guān)。有研究顯示，增加對ahpC啟動子區(qū)的檢測，可將異煙肼耐藥的檢測敏感度提高8.5%[7]。馬曉光等[22]應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法對408例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行異煙肼耐藥檢測，與藥敏試驗相比，特異度和敏感度分別為95.32%和87.69%，與本研究相近。而馬艷艷等[23]則應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法對347例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行利福平耐藥檢測，與藥敏試驗相比，特異度和敏感度分別為97.42%和93.42%，也與本研究結(jié)果相近。不同之處在于，馬曉光等[22]和馬艷艷等[23]的樣本類型均為結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，而本研究采用的是痰液樣本。此外，上述兩項研究的對照方法均為比例法固體藥敏試驗，而本研究采用的是MGIT 960液體藥敏試驗?？梢?，對于不同的樣本類型以及不同的藥敏試驗對照方法，熒光PCR熔解曲線法均可獲得良好的檢測效果。此外，對于熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥，而藥敏試驗結(jié)果為敏感的情況，一方面可能由于操作失誤導(dǎo)致錯誤結(jié)果；另一方面可能與耐藥突變類型有關(guān)，部分突變類型(如rpoB533位點突變)所導(dǎo)致的耐藥水平處于臨界狀態(tài)或者僅導(dǎo)致低水平耐藥[24]，可造成檢測結(jié)果與藥敏試驗結(jié)果出現(xiàn)差異。

目前，已有很多研究表明探針熔解曲線熒光PCR熔解曲線法可用于結(jié)核分枝桿菌耐藥突變的快速檢測[10-13]。本次研究也獲得了與傳統(tǒng)方法較為一致的結(jié)果，提示熒光PCR熔解曲線法適用于對利福平和異煙肼進(jìn)行快速耐藥篩查，以輔助臨床診斷。在臨床應(yīng)用過程中，該方法對加入反應(yīng)體系的DNA模板質(zhì)量要求較高，若采用常規(guī)水煮法對痰樣本進(jìn)行DNA提取，可能會因為模板純度低導(dǎo)致熔點偏移或擴(kuò)增抑制，因此，建議采用磁珠法或其他可獲得高質(zhì)量模板的提取方法來提取痰樣本。此外，該試劑盒目前僅采用雙色熒光對探針進(jìn)行標(biāo)記，對應(yīng)每個樣本需要2個反應(yīng)管來實現(xiàn)耐藥檢測，若可以充分利用目前主流實時PCR儀的四個熒光通道，采用四色熒光標(biāo)記，則能使反應(yīng)管數(shù)減半，進(jìn)而提高樣本檢測通量。后續(xù)可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，確定耐藥突變位點是否有明顯的地域差異以及不同的突變位點的菌株耐藥水平的高低，以期為結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的診治提供參考依據(jù)。