正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選地歸生血口服液提取工藝

張玲昂，王俊杰，張松亮，劉 弘

地歸生血口服液由熟地、當(dāng)歸、黃芪、何首烏、枸杞子等八味中藥組成，具有生血益氣、健脾固本之功效。臨床主要用于神倦乏力、面色萎黃、貧血和放療、化療及多種原因引起的白細(xì)胞、血小板減少。為了規(guī)范地歸生血口服液的提取工藝，根據(jù)處方中藥物各組分的理化性質(zhì)及藥理特點(diǎn)，結(jié)合中醫(yī)臨床用藥的特點(diǎn)，采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)處方中當(dāng)歸、黃芪、白術(shù)進(jìn)行醇提，其藥渣與其他藥材再水提的試驗(yàn)方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

島津 LC－20AT高效液相色譜儀；SPD－10MA二極管陣列檢測器；島津LC－色譜工作站；AUW120D電子分析天平；島津UV－2401PC紫外分光光度計(jì)。阿魏酸 （批號(hào)110773—201012，純度99.6%），二苯乙烯苷（批號(hào) 110844－201109，純度94.7%），無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào) 17－0330－01，純度99.9%），均有中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純；水為注射用水；磷酸為分析純。處方中熟地、當(dāng)歸等藥材為解放軍第一五二中心醫(yī)院藥學(xué)部采購，經(jīng)趙國景主任中藥師鑒定，均符合《中國藥典》2015版標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 考察指標(biāo)的測定

2.1.1 干膏收率的測定 將按正交實(shí)驗(yàn)取得的各提取液濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容，搖勻后精密量取20 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴干燥，殘?jiān)?05℃干燥至恒重，取出，迅速置于干燥器中放冷，精密稱定，計(jì)算干膏收率。

2.1.2 阿魏酸的含量測定［1，2］（1）色譜條件。色譜柱為 Wondasil C18柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈－0.1%磷酸（20∶80）；流速 1.0 ml/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量 10μl；檢測波長 322 nm。（2）對(duì)照品溶液的制備。精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量，置50 ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成1 ml含204.6μg的阿魏酸貯備液。精密量取上述溶液5 ml至25 ml容量瓶中用流動(dòng)相定容，搖勻，即為對(duì)照品溶液。（3）供試品溶液的制備。精密量取各供試品提取濃縮液10 ml至25 ml容量瓶中，流動(dòng)相定容，搖勻，離心，上清液用微孔濾膜過濾，接取續(xù)濾液，即得。（4）陰性對(duì)照溶液。按照地歸生血口服液的處方醇提藥材制備不含當(dāng)歸的樣品，按制備供試品項(xiàng)下的方法制成陰性對(duì)照溶液。（5）專屬性試驗(yàn)。取上述三種溶液各10μl按色譜條件進(jìn)行測定，阿魏酸峰和供試品中其他組分色譜峰可達(dá)到良好分離，陰性對(duì)照溶液對(duì)阿魏酸的測定無干擾，見圖1。（6）線性關(guān)系的考察。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 1、2、4、8、16 ml分別至25 ml容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，分別精密吸取該對(duì)照品溶液各10μl，按色譜條件進(jìn)樣。以阿魏酸質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=6613965X－368294，r=0.9998，線性范圍 0.082～1.309 μg。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3 二苯乙烯苷的含量測定［3，4］（1）色譜條件。色譜柱為 Wondasil C18柱 （5μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相：乙腈－0.05%磷酸（16∶84）；流速 1.0 ml/min；柱溫 35℃；進(jìn)樣量 10μl；檢測波長 320 nm。 （2）對(duì)照品溶液的制備。精密稱取二苯乙烯苷對(duì)照品適量，置50 ml棕色容量瓶中，甲醇溶解，定容，搖勻，制成287.5μg/ml的二苯乙烯苷貯備液，精密量取上述溶液1 ml至10 ml容量瓶中用流動(dòng)相定容，搖勻，即為對(duì)照品溶液。（3）供試品溶液的制備。精密量取各供試品提取濃縮液1 ml至50 ml容量瓶中，稀乙醇定容，搖勻，離心，上清液用微孔濾膜濾過，接取續(xù)濾液，即得。（4）陰性對(duì)照溶液。按照地歸生血口服液的處方水提藥材制備不含何首烏的樣品，按供試品項(xiàng)下的方法制成陰性對(duì)照溶液。（5）專屬性試驗(yàn)。取上述三種溶液各10μl按色譜條件進(jìn)行測定，二苯乙烯苷峰和供試品中其他組分色譜峰可達(dá)到良好分離，陰性對(duì)照溶液對(duì)二苯乙烯苷的測定無干擾，見圖2。（6）線性關(guān)系的考察。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 1、2、4、8、16 ml分別至 25 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，再分別精密吸取該對(duì)照品溶液各10μl，按色譜條件進(jìn)樣。以二苯乙烯苷質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=1274789X－31306，r=1.0000，線性范圍 0.115～1.84μg。

圖2 高效液相色譜圖

2.1.4 多糖的含量測定 采用硫酸－苯酚法對(duì)多糖含量進(jìn)行測定［5］。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定無水葡萄糖對(duì)照品適量，置100 ml容量瓶中，加水適量溶解，定容，搖勻，即得（每1 ml中含無水葡萄糖0.1206 mg）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對(duì)照品溶液0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，分置具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2.0 ml，分別精密加入5%苯酚溶液1 ml，搖勻，迅速精密加入硫酸5 ml，搖勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，紫外－可見分光光度法在490 nm的波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為A=8.8889C－0.0146，r=0.9998， 線 性 范 圍 3.015～15.075 μg/ml。

測定法：精密量取本品1 ml，加水至5 ml，加95%乙醇使含醇量至80%，邊加邊攪拌，離心，棄去上清液，殘?jiān)舆m量水溶解，定容至50 ml量瓶中，濾過，精密量取續(xù)濾液1 ml至10 ml容量瓶中，定容，再精密量取1 ml，置具塞試管中，加水1.0 ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“各精密加人5%苯酚溶液1 ml”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量（mg），計(jì)算，即得。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.2.1 醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［6］地歸生血口服液中黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)的主要有效成分易溶于醇，故以一定濃度乙醇為溶媒提取。預(yù)試驗(yàn)表明，浸泡時(shí)間（預(yù)浸泡0.5 h即可）對(duì)提取影響較小，故決定對(duì)提取影響較大的乙醇倍數(shù)、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素3個(gè)水平，采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，以阿魏酸轉(zhuǎn)移率和浸膏收率為考察指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)見表1。

正交實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果［4］：稱取1/10處方量的當(dāng)歸等藥材9份，按正交實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行提取，合并煎液，濾過，減壓濃縮至約100 ml，離心，上清液轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容，備用。

正交實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果見表2，方差分析見表3，確定優(yōu)化的提取條件。

結(jié)果表明，以阿魏酸轉(zhuǎn)移率和干膏得率的綜合為評(píng)價(jià)指標(biāo)，直觀分析各因素影響程度依次是D＞A＞B＞C，最佳提取方案為 A3B2C2D2；方差分析結(jié)果表明提取次數(shù)（D）有顯著性影響（P＜0.05），因此，綜合4種因素對(duì)阿魏酸和總浸膏量的影響，確定A3B2C2D2為最佳提取工藝，即以8倍量60%乙醇提取回流2次，2.0 h/次。

表1 醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 醇提工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件提取處方量的黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)三味藥材，共三份，測定阿魏酸轉(zhuǎn)移率和干膏得率，結(jié)果見表4。

由驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，阿魏酸轉(zhuǎn)移率為96.7%，RSD值1.24%；干膏得率為27.4%，RSD值1.32%，說明優(yōu)選出的最佳工藝參數(shù)重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。

2.2.2 水提工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［7，8］根據(jù)地歸生血口服液中熟地黃、枸杞子、何首烏等藥材所含成分的性質(zhì)和特點(diǎn)，采用水煎煮法進(jìn)行提取。取十分之一處方量的藥材與當(dāng)歸、黃芪、白術(shù)醇提后的藥渣共煎，合并提取液，濾過，濾液濃縮至適量轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容，備用。以二苯乙烯苷，總多糖，干膏得率為考察指標(biāo)，選定加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素，采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)表見表5。

正交實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果見表6，方差分析見表7，確定優(yōu)化的提取條件。

表3 醇提工藝各影響因素方差分析表

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)阿魏酸轉(zhuǎn)移率和干膏得率

表5 水提工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表6 水提工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及分析

表7 水提工藝各影響因素方差分析表

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率、總多糖含量和干膏得率

結(jié)果表明，以二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率、總多糖含量和干膏得率的綜合為評(píng)價(jià)指標(biāo)，直觀分析各因素影響順序是 C＞A＞B，最佳提取方案為 A1B3C3；方差分析結(jié)果表明提取次數(shù) （C）有非常顯著性影響 （P＜0.01）、加水量（A）有顯著性影響（P＜0.05），所以，綜合三種因素對(duì)二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率、總多糖含量和干膏得率的影響，確定A1B3C3為最佳提取工藝，再對(duì)兩分析表研究，提取時(shí)間（B）無顯著性影響，且隨著提取總時(shí)間的延長，二苯乙烯苷發(fā)生降解，從節(jié)約能源、提高生產(chǎn)權(quán)重角度講，最終確定A1B1C3為最佳提取工藝，即以12倍量水提取回流3次，1.0 h/次。

驗(yàn)證試驗(yàn)：按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件提取處方量的各味藥材，共三份，測定二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率、總多糖含量和干膏得率，結(jié)果見表8。

由驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率為87.5%，RSD值1.28%；總多糖含量為27.3 mg/ml，RSD值1.32%；干膏得率為37.4%，RSD值1.34%，說明優(yōu)選出的最佳工藝參數(shù)重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。

3 討論

3.1 地歸生血口服液的藥性分析 君藥為當(dāng)歸、熟地，方中當(dāng)歸甘辛為溫，補(bǔ)血活血，《日華子本草》云“治一切風(fēng)，一切血，補(bǔ)一切老、破惡血，養(yǎng)新血及癥廦”，其主要成分為阿魏酸；熟地黃甘微溫，可補(bǔ)血滋陰，益精填髓。用于血虛萎黃。《本草正》：“諸經(jīng)之明血虛者，非熟地不可”，《珍珠囊》：“大補(bǔ)血虛不足，通血脈，益氣力。”其熟地黃多糖為其補(bǔ)血作用的有效部位［9］，方中枸杞子等亦含有多糖成分；何首烏苦甘澀、微溫，補(bǔ)肝腎，益精血，用于血虛萎黃。《重慶堂隨筆》：“何首烏，內(nèi)調(diào)氣血，外散瘡瘍，攻似當(dāng)歸，血中氣藥”。熟地黃、何首烏共補(bǔ)陰，何首烏為陰中之陽藥，專入肝經(jīng)以為益血祛風(fēng)之用，二苯乙烯苷為其主要成分。

3.2 提取時(shí)間 二苯乙烯苷在高溫高濕環(huán)境下，性質(zhì)不穩(wěn)定，不宜長時(shí)間加熱，從正交試驗(yàn)結(jié)果二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率中就可以看出，所以提取時(shí)間的水平點(diǎn)從1 h起。

3.3 試驗(yàn)工藝優(yōu)選 醇提工藝為以8倍量60%乙醇提取回流2次，2.0 h/次。水提工藝為12倍量水提取回流3次，1.0 h/次。