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    低頻電磁場模擬腦電節(jié)律儀對SD大鼠腦含水量及外周血IL-6和TNF-α的影響*

    2018-09-13 09:01:46郭紅燕張金濤李乃義王鳳嬌劉勝松
    實用醫(yī)藥雜志 2018年9期
    關(guān)鍵詞:電磁場腦電節(jié)律

    郭紅燕,張金濤,李乃義,王鳳嬌,劉勝松

    低頻電磁場模擬腦電節(jié)律儀,是筆者所在醫(yī)院自主研制并獲得國家專利(國家實用新型專利公開號:CN201320347)的儀器。此儀器采用低頻電磁場輻射方式進行設(shè)計,通過模擬腦電節(jié)律的電磁場對腦進行刺激,是治療神經(jīng)、心理、精神疾病的新手段[1],用于治療軍人心理應(yīng)激反應(yīng)效果顯著[2]。 為進一步驗證其應(yīng)用安全性,該研究采用腦電節(jié)律儀干預(yù)正常SD大鼠后,觀察其對腦水腫和外周血IL-6、TNF-α的表達的影響。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料

    1.1.1 實驗動物及分組 購于北京維通利華實驗動物技術(shù)公司的SD大鼠60只,雌雄各30只,健康清潔級,8 周齡,體重(230±20) g,控制動物房 12 h白黑交替,溫度為(23±2)℃,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 W。先將正常SD大鼠隨機分為四組,每組15只,實驗組在每日固定時間進行干預(yù),發(fā)射源固定于清醒態(tài)大鼠顱頂骨外約2 cm處,1次/d,每次0.5 h,分別為正常對照組(A組),每日置于相同的固定裝置內(nèi)不予以治療;1 HZ 組 (B 組);10 HZ 組(C 組);20 HZ 組 (D組),每日均在固定時間干預(yù),30 min/d,連續(xù)7 d。

    1.1.2 實驗試劑及設(shè)備 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(IL-6購于南京建成生物工程研究所、TNF-α購于依科賽生物科技有限公司)、低頻電磁場模擬腦電節(jié)律儀(解放軍第八十八醫(yī)院)、臺式冷凍高速離心機(德國 Eppendorf 5810R)、電恒溫烤箱(江蘇太倉市實驗廠)、全自動酶標(biāo)儀 (美國Biotek ELX800UV)、全自動洗板機 (美國 Biotek ELX50/6)、超純水系統(tǒng)(英國 Elga Puelab Bioscien)、漩渦混勻儀(美國 SCI Vortex)、超低溫冰箱(-80 ℃,丹麥 Heo-Holten 3410)、單通道精密移液器 (德國Eppendorf Research)。

    1.2 方 法

    1.2.1 標(biāo)本采集 干預(yù)結(jié)束后進行標(biāo)本采集,在室溫25℃條件下,用10%水合氯醛0.4 ml/100 g行腹腔麻醉注射。麻醉成功后,大鼠仰臥固定四肢,在胸骨左側(cè)心臟搏動最強點穿刺,用抗凝采血管抽血約5 ml,混勻后高速離心機3000轉(zhuǎn)/min離心10 min后取上清液,分裝于離心管內(nèi),凍存于-80℃冰箱留待批量指標(biāo)檢測,采血完成后快速從上頸椎處剪斷頸髓,剪除顱骨小心剝離腦膜,從延髓開始分離輕輕取出整腦,稱腦濕重。置于100℃烤箱烤24 h,稱腦干重。

    1.2.2 腦組織含水量測定 大鼠麻醉后迅速斷頭取腦。用濾紙吸除腦組織表面的水分,電子分析天平(精確至0.001 g)稱取濕重(W),再將腦組織置于100℃的恒溫干燥箱烘烤24 h稱取其干重(D)。應(yīng)用Elliot公式計算腦組織的含水量:腦組織含水量(%)(BWC)=(濕重-干重)/濕重×100%。

    1.2.3 血清學(xué)ELISA指標(biāo)檢測 (1)室溫解凍血清標(biāo)本后備用。(2)自試劑盒中取出所需酶標(biāo)板條,室溫復(fù)溫30 min,將剩余板條密封放回4℃冰箱保存。(3)標(biāo)準(zhǔn)品的配置:1、2、3、4、5 號 IL-6 標(biāo)準(zhǔn)品依次為 5 ng/L、10 ng/L、20 ng/L、40 ng/L、80 ng/L。1、2、3、4、5、6、7、8 號 TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)品依次為 0 pg/ml、31.25 pg/ml、62.5 pg/ml、125 pg/ml、250 pg/ml、500 pg/ml、1000pg/mL、2000pg/mL。 (4)設(shè)置好樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白孔,做復(fù)孔。(5)加樣:①空白孔不加樣品、生物素標(biāo)記的抗 IL-6(TNF-α)抗體、鏈霉親和素-HRP,只加顯色劑和終止液,其余各部操作相同;②標(biāo)準(zhǔn)品孔加標(biāo)準(zhǔn)品50μl、鏈霉親和素-HRP50μl;③樣本孔先加待測樣本40μl,再加生物素標(biāo)記的抗 IL-6(TNF--α)抗體 10 μl、鏈霉親和素-HRP50μl, 蓋上封板膜,IL-6在 37℃恒溫箱溫育 60 min(TNF-α 室溫 120 min)。 (6)配液:將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋成20×應(yīng)用液,備用。(7)洗滌:到時間后,棄去孔內(nèi)液體,并用吸水紙吸干,入洗板機重復(fù)洗板5次,拍干。(8)顯色:每孔顯色劑A、B各 50 μl,混勻,37℃避光孵育 10 min。(9)終止:各孔加入終止液50μl,終止反應(yīng) (此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。(10)測定:以空白孔調(diào)零,終止反應(yīng)10 min內(nèi)

    測定,450 nm波長通過酶標(biāo)儀測定各孔的OD值。(11)實驗結(jié)果計算:以酶標(biāo)孔中標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值通過作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(X軸為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,Y軸為相應(yīng)的吸光度值),并根據(jù)樣品吸光度值在該曲線圖上分別求得相應(yīng)的大鼠血清學(xué)IL-6與TNF-α的濃度。

    1.2.4 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。組間比較采用單因素方差分析(F檢驗)。均數(shù)兩兩比較采用LSD法 (最小顯著差異法),P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 實驗動物一般情況分析 整個實驗過程,無動物傷亡事件,精神飲食均正常,活動正常,大小便正常,實驗組與正常對照組的大鼠體重均呈持續(xù)增長狀態(tài)。

    2.2 IL-6的ELISA檢測結(jié)果 正常對照組在血清中含量較低;各實驗組中含量表達無明顯變化,與正常對照組比較(P=0.999),差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

    表1 大鼠外周血IL-6的表達(濃度)結(jié)果

    2.3 TNF-α的ELISA檢測結(jié)果 正常對照組在血清中含量較低;實驗組中含量表達無明顯變化,與對照組比較(P=0.935),差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

    表2 大鼠外周血TNF-α的表達(濃度)結(jié)果

    2.4 干預(yù)后大鼠腦組織的干濕重變化 A組、B組、C組、D組大鼠腦組織含水量分別為77.45±0.009、77.58±0.008、77.54±0.009、77.65±0.009 (P>0.05),組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

    表3 大鼠腦含水量的表達結(jié)果

    3 討論

    腦電節(jié)律儀在治療精神疾病方面具有一定的應(yīng)用價值,其原理主要是:通過誘導(dǎo)使大腦的兩半球進入一種同步的狀態(tài)(brain sync),即腦波同步狀態(tài),并誘發(fā)人腦產(chǎn)生α、β、θ、δ頻率的腦電波,這幾種腦電波與人的精神狀態(tài)有著至關(guān)重要的聯(lián)系[1]。目前,通常采用的誘導(dǎo)方式主要是通過聲光刺激與低頻電脈沖刺激;與之不同,筆者研制的腦電節(jié)律同步調(diào)節(jié)儀主要采用了低頻電磁場輻射方式,通過人工制造的腦電節(jié)律電磁場對人體腦部進行刺激誘導(dǎo)[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)顱磁刺激可以改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的抑郁行為及海馬神經(jīng)元的凋亡[3],并對可促進腦梗死后空間學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)[4];筆者之前通過水迷宮數(shù)據(jù)的變化研究也發(fā)現(xiàn),采用模擬腦電節(jié)律儀的低頻電磁場對正常大鼠的認知功能無不良影響,可能有改善作用[5]。

    近年研究表明腦組織的損傷與炎癥反應(yīng)相關(guān)[3,4]。IL-6、TNF-α為促炎癥性細胞因子,主要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,參與免疫細胞發(fā)育、刺激造血、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及參與組織修復(fù)等。IL-6是具有促進生長和分化等調(diào)節(jié)功能的炎癥細胞因子,主要生物學(xué)功能是作為細胞分化因子,促進各類免疫細胞和造血細胞的分化、增殖,并介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)。在機體生理或病理條件下都發(fā)揮重要作用,不僅作用于免疫系統(tǒng),還廣泛作用于神經(jīng)[5]、內(nèi)分泌和心血管等系統(tǒng)。脈絡(luò)叢室管膜細胞、血管內(nèi)皮細胞、星形細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元等中樞神經(jīng)細胞在不同損傷或刺激下可產(chǎn)生IL-6。大量的資料表明,在正常情況下腦內(nèi)IL-6僅有低水平表達,腦損傷后表達明顯增加。在腦損傷的早期IL-6水平明顯增高,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與腦水腫的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)元的退變和丟失以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫方面起著重要作用,而晚期IL-6水平再次升高,促進了腦組織的再生和修復(fù),并可誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞增生和血管的形成[6]。目前研究表明IL-6的作用可能通過以下機制:IL-6 與其受體(IL-6Ra)結(jié)合后,識別信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分gp130,三者共同形成生物活性的三元復(fù)合體,該復(fù)合體激活細胞內(nèi)的多種激酶,導(dǎo)致蛋白磷酸化和基因表達,進而發(fā)揮生物學(xué)作用。腦損傷后,不同實驗動物腦組織、腦脊液和血清中均可以檢測到IL-6 和 IL-6 受體水平升高[7]。 IL-6 水平增高可以出現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷及感染性病患中。在顱腦損傷早期神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以產(chǎn)生IL-6等細胞因子,使神經(jīng)系統(tǒng)及外周血中IL-6的含量顯著增高[8]。

    TNF-α是被激活的巨噬細胞分泌的一種前炎癥細胞因子,是炎癥反應(yīng)重要的起始因子之一。TNF-α可在全身發(fā)揮作用,具有廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)活性,釋放增加引起多核白細胞激活聚集并釋放炎癥介質(zhì),誘導(dǎo)缺血神經(jīng)元壞死和凋亡。TNF-α細胞來源極為廣泛,各種免疫細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞、角質(zhì)細胞、平滑肌細胞以及急性腦缺血后的小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元等均可分泌TNF-α。TNF-α作為致炎因子通過誘發(fā)和促進炎癥、細胞毒性、凝血等多種凋亡途徑加劇缺血損傷[9]。損傷后TNF-α快速升高,具有神經(jīng)毒性作用,加速神經(jīng)死亡。TNF-α還加重腦水腫,損傷血腦屏障,促進趨化因子的生成,誘導(dǎo)白細胞聚集,產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)。動物實驗表明[10],腦損傷發(fā)生后,血漿及腦組織 TNF-α、IL-6含量均出現(xiàn)變化。細胞因子 IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-8 等通過炎癥細胞的活化,使血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的通透性增加[11]。TNF-α早期主要通過對毛細血管的直接毒性作用,使毛細血管的通透性增加,開放BBB,導(dǎo)致腦水腫。

    既往研究表明,經(jīng)顱磁刺激能利用時變磁場產(chǎn)生感應(yīng)電場,引起生物電流在組織中傳導(dǎo),使得神經(jīng)纖維、神經(jīng)元和肌肉去極化,用以改變皮質(zhì)神經(jīng)細胞的動作電位,影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動[12,13]。經(jīng)顱磁刺激治療廣泛性焦慮障礙的療效顯著[14];趙琳等研究經(jīng)顱磁刺激可以改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的抑郁行為及海馬神經(jīng)元的凋亡[15]。張靖慧等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)顱磁刺激對可促進腦梗死后空間學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù),并可能通過增加患側(cè)海馬區(qū)IL-1βmRNA表達來實現(xiàn)[16]。而經(jīng)顱磁刺激對正常大鼠周圍血TNF-α、IL-6的影響鮮有報道。筆者所在醫(yī)院自主研制的腦電節(jié)律儀其作用機制是:采用低頻電磁場方式制造的腦電節(jié)律對腦部進行刺激,利用反饋原理起安眠、精神松弛等治療效果,為治療精神疾病及心理疾病提供了新手段,而且不存在藥物依賴及不良作用。

    該研究進一步通過干預(yù)正常大鼠,觀察了該節(jié)律儀所采用低頻電磁場對腦含水量及外周血白介素-6、TNF-α的影響。研究發(fā)現(xiàn),與對照組比較,實驗組在每日固定時間,1次/d,30 min/次,連續(xù)7 d進行低頻電磁場輻射后,1 HZ組 (B組);10 HZ組(C組);20 HZ組(D組)大鼠腦組織含水量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;正常對照組在血清中IL-6、TNF-α含量均較低;低頻電磁場輻射1周后各實驗組中含量表達無明顯變化,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明腦電節(jié)律儀對正常大鼠周圍血清中的TNF-α、IL-6含量無明顯影響,既沒有破壞血腦屏障導(dǎo)致腦水腫,又未啟動機體的炎癥免疫反應(yīng),對大鼠具有安全性。該研究探討了TNF-α、IL-6因子結(jié)合腦水腫反映其安全性,但是有關(guān)確切機制和臨床還有待進一步驗證。

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