丹溪痛風(fēng)膠囊對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠RORγt和Foxp3蛋白表達(dá)的影響＊

韓玉生，李東東，侯志濤，樸成玉，周忠光

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種臨床常見(jiàn)自身免疫性疾病，主要由于炎癥引起關(guān)節(jié)滑膜、軟骨和骨質(zhì)破壞，近期研究發(fā)現(xiàn)RA的發(fā)生發(fā)展與Th17和Treg細(xì)胞密切相關(guān)［1］。丹溪痛風(fēng)膠囊組方來(lái)源于《丹溪心法》中所載的上中下痛風(fēng)方，現(xiàn)代臨床上應(yīng)用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，取得了良好治療效果［2］。該研究在2015年8月—12月進(jìn)行，選取30只SD大鼠，通過(guò)CIA大鼠模型，觀察丹溪痛風(fēng)膠囊對(duì)脾組織淋巴細(xì)胞中RORγt和Foxp3蛋白表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK魯20140001。在安靜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 W，室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度55%～60%。給予充足清潔飲水，自由攝食。

1.1.2 藥物與試劑 丹溪痛風(fēng)膠囊由蒼術(shù)、黃檗、防己、威靈仙、制南星、澤瀉、車(chē)前子各15 g，川芎、桃仁、紅花、羌活、桂枝各10 g，土茯苓25 g，萆薢20 g組成，0.5 g/粒，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；牛Ⅱ型膠原蛋白與弗氏不完全佐劑（IFA）購(gòu)自美國(guó)sigma公司；兔抗大鼠RORγt和Foxp3多克隆抗體，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒等試劑均由賽諾博公司提供；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑由Roche提供；山羊抗兔 IgG（H+L），HRP、山羊抗小鼠 IgG（H+L），GAPDH鼠單抗由天德悅公司提供。

1.1.3 主要儀器 MultiSkan3酶標(biāo)儀 （Thermo），垂直電泳儀、濕轉(zhuǎn)電泳槽（北京六一），水平脫色搖床（其林貝爾），凝膠成像系統(tǒng) （以色列MiniLumi公司），低溫冷凍離心機(jī)（上海安亭）；電子天平（梅特勒公司），大鼠足趾腫脹儀（成都泰盟）。

1.2 方 法

1.2.1 模型制作 采用牛Ⅱ型膠原蛋白與等量的弗氏不完全佐劑混合方法制備CIA造模劑，在大鼠尾根部、背部、右后肢足趾皮內(nèi)注射，0.4 ml/只。在首次注射后的第21天時(shí)按上述方法再注射0.2 ml/只進(jìn)行免疫加強(qiáng)。通過(guò)觀測(cè)大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)模型是否成功。

1.2.2 分組及給藥 CIA模型制備成功大鼠隨機(jī)分為3組：模型組、丹溪痛風(fēng)膠囊組，另選取正常大鼠作為對(duì)照，每組10例。采用灌胃進(jìn)行治療，丹溪痛風(fēng)膠囊組給藥劑量通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定為6.4 g/kg；正常組和模型組均給予等容積的生理鹽水。各組大鼠連續(xù)給藥28 d。

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù) 在造模前、后和治療后分別檢測(cè)各組大鼠左、右后足跖的容積，并計(jì)算其平均足跖容積，分析足趾腫脹度。分別在造模后和治療后根據(jù)大鼠關(guān)節(jié)紅腫程度、范圍和關(guān)節(jié)腫大變形情況，采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.2 脾組織淋巴細(xì)胞中RORγt和Foxp3蛋白表達(dá) 末次給藥后4 h，處死大鼠，無(wú)菌條件下取脾去掉多余的脂肪組織，稱(chēng)取一定量的脾組織放入200目鋼網(wǎng)中，加入一定量PBS反復(fù)碾磨制備淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液。4℃，1700 r/min離心5min，棄上清。Western blot技術(shù)檢測(cè)RORγt和Foxp3蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示。采用單因素方差分析，組間比較t檢驗(yàn)，方差齊，用LSD檢驗(yàn)；方差不齊，用Dennett’s檢驗(yàn)；以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 丹溪痛風(fēng)膠囊對(duì)RA大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 丹溪痛風(fēng)膠囊對(duì)RA大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.01；與模型組相比較，★P＜0.01。

關(guān)節(jié)炎指數(shù)造模21 d 治療28 d 造模21 d 治療28 d對(duì)照組 1.82±0.75 4.78±0.81 0.64±0.35 0.78±0.31模型組 16.39±3.15△ 15.27±3.42△ 8.19±0.64△ 8.75±1.72△丹溪痛風(fēng)膠囊組 16.89±4.15△★ 6.56±2.14★△ 8.45±0.81△ 2.54±0.82★△組別 足趾腫脹度

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù) 與對(duì)照組相比較，造模21 d時(shí)各組大鼠、治療28 d模型組大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯增加，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比較，丹溪痛風(fēng)膠囊組大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯減少，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠脾中RORγt和Foxp3蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中RORγt和Foxp3水平明顯升高，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，丹溪痛風(fēng)膠囊組大鼠血清中RORγt和Foxp3水平明顯降低，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 丹溪痛風(fēng)膠囊對(duì)RA大鼠脾中RORγt和 Foxp3 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）

表2 丹溪痛風(fēng)膠囊對(duì)RA大鼠脾中RORγt和 Foxp3 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.01；與模型組相比較，★P＜0.01。

組別 RORγt Foxp3 RORγt/Foxp3對(duì)照組 0.452±0.048 1.585±0.039 0.285模型組 1.724±0.067△ 0.418±0.043△ 4.12丹溪痛風(fēng)膠囊組 0.621±0.073★△ 0.976±0.067★△ 0.62

3 討論

CD4+T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，Th17和Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的兩個(gè)亞群，近年來(lái)研究認(rèn)為T(mén)h17/Treg細(xì)胞失衡與RA發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程密切相關(guān)。RORγt和Foxp3分別是Th17和Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，RORγt表達(dá)增多能促進(jìn)Th17細(xì)胞分化和IL－17的分泌，促進(jìn)RA炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展［3－5］，F(xiàn)oxp3 可促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子IL－10、TGF－β等分泌，具有抗炎和對(duì)免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能［6］。因此RORγt/Foxp3平衡能決定初始T細(xì)胞受抗原刺激后向Th17或Treg方向分化，從根本上影響到Th17/Treg的平衡。

臨床研究表明，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血RORγt水平明顯升高，F(xiàn)oxp3水平明顯降低，RORγt/Foxp3比值明顯增加。川芎嗪能明顯下調(diào)外周血 RORγt水平，降低 IL－17，升高 Foxp3 水平，提高類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者免疫功能，從而減輕炎癥反應(yīng)，改善患者臨床癥狀及不良預(yù)后［7］。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究表明，Treg細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)量在Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠淋巴細(xì)胞中均明顯升高，其動(dòng)態(tài)變化與RA進(jìn)展關(guān)系密切［8］。薏苡仁酯能上調(diào)CIA小鼠外周血中Foxp3+CD4+CD25+Treg比例，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)對(duì)RA起到治療作用［9］。薯蕷皂苷能顯著降低膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠淋巴細(xì)胞中RORγtmRNA水平，升高Foxp3mRNA 水平，通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡而對(duì)RA起到治療作用［10］。

該研結(jié)果表明，CIA大鼠脾組織淋巴細(xì)胞中RORγt蛋白表達(dá)明顯升高，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)明顯降低，分別為 1.724±0.067 和 0.418±0.043。丹溪痛風(fēng)膠囊治療后，RORγt蛋白表達(dá)明顯降低，而Foxp3蛋白表達(dá)明顯升高，分別為0.621±0.073和0.976±0.067。丹溪痛風(fēng)膠囊通過(guò)調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)的平衡，抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)及滑膜炎癥的進(jìn)程，從而達(dá)到治療RA作用。