超氧化物歧化酶對(duì)復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍家兔T細(xì)胞亞群水平變化的影響

甘成文 鄧 偉 廖天安 張 熹 馮冬嬋 王 濤

(海南省人民醫(yī)院口腔頜面外科，海南 ?？?570311)

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍(RAU)見(jiàn)于口腔黏膜幾乎所有部位，發(fā)病率高且易反復(fù)發(fā)作，病程周期長(zhǎng)常伴有明顯灼痛感〔1〕。引起RAU的因素包括：基因決定的遺傳因素、環(huán)境因素、免疫力低下、感染、潰瘍等消化系統(tǒng)疾病等，但其具體致病機(jī)制尚不明確，但是氧自由基的增多被廣泛認(rèn)為是導(dǎo)致RAU頻繁發(fā)作的主要原因之一〔2，3〕。超氧化物歧化酶(SOD)是一種生物活性物質(zhì)是重要的抗氧化酶之一，也是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，可有效清除體內(nèi)自由基等保護(hù)機(jī)體免受傷害。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討SOD對(duì)家兔T細(xì)胞亞群水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑、儀器 雄性普通級(jí)家兔30只，體重1.5～2.0 kg，單籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫(20±2)℃，相對(duì)平均濕度45%，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和SOD組各10只。流式細(xì)胞儀：CytoFLEX型，貝克曼公司；病理切片機(jī)：CUT4062型，德國(guó)SLEE公司；勻漿機(jī)：T10型，德國(guó)IKA公司；乙醚：德音化工；甲基紫精：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；SOD生物膠囊：EP1317，福建華燦生物科技有限公司；白細(xì)胞介素(ILs)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；血細(xì)胞裂解液：上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司。

1.2RAU模型建立 在室溫20～22℃取家兔兔板固定，乙醚麻醉，止血鉗分開(kāi)其上下頜，鋼平尺鑷輕輕抻拉出家兔的右側(cè)頰囊部，然后選用5號(hào)皮試注射器，準(zhǔn)確地均勻扇形注射約0.25 ml甲基紫精溶液，于右側(cè)頰囊部位黏膜下層大約0.8 cm處緩慢推入。24 h后在注射部位黏膜可見(jiàn)潰瘍形成。待家兔在口腔黏膜反復(fù)多次出現(xiàn)規(guī)則圓形或橢圓形的邊緣整齊且表面覆有灰黃色假膜的潰瘍，鏡下組織病理表現(xiàn)為潰瘍表面覆蓋有大量壞死組織和炎性的滲出物，潰瘍基底部毛細(xì)血管擴(kuò)張，同時(shí)伴有中性、淋巴及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，可確定為模型建立完成〔4,5〕，納入陽(yáng)性對(duì)照組和SOD組。

1.3給藥方法 SOD組每天進(jìn)行SOD生物膠囊溶液灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組給予蒸餾水灌胃，藥物劑量1 g/次，頻率3次/d，連續(xù)2 w〔4〕。

1.4組織病理學(xué)觀察 模型建立完成2 d后，取陽(yáng)性對(duì)照組和SOD組口腔潰瘍病變組織；灌胃 7 d后，取陽(yáng)性對(duì)照組和SOD組口腔潰瘍病變組織，經(jīng)過(guò)HE染色后鏡下進(jìn)行組織學(xué)檢查?？瞻讓?duì)照組取相應(yīng)位置口腔黏膜組織進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè) 將CD4+/CD8+免洗試劑加入到絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，再加抗凝血試劑室溫避光孵育15 min，再加血細(xì)胞裂解液室溫孵育15 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀軟件分析檢測(cè)。

1.6ELISA檢測(cè) 各組血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6和IL-8檢測(cè)，在分別取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，模型建立完成時(shí)及灌胃結(jié)束時(shí)，SOD組、陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì)照組耳緣靜脈血4 ml，以口腔黏膜組織勻漿液作為抗原，來(lái)檢測(cè)血清中抗口腔黏膜組織勻漿液的抗體〔6，7〕。按ELISA試劑盒使用說(shuō)明嚴(yán)格操作。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1組織病理學(xué)觀察 空白對(duì)照組黏膜上皮連續(xù)完整，固有層結(jié)締組織致密，黏膜下層較厚可見(jiàn)小涎腺體；陽(yáng)性對(duì)照組黏膜表面有斷裂，覆蓋假膜，并且有密集淋巴細(xì)胞、固有層有大量單核細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，毛細(xì)血管存在充血性擴(kuò)張，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈腫脹狀，且可見(jiàn)壞死區(qū)域；SOD組各個(gè)潰瘍面表現(xiàn)為愈合狀態(tài)，上皮可見(jiàn)完整且增厚組織，黏膜下有松散的結(jié)締組織存在，并且有新鮮毛細(xì)血管。見(jiàn)圖1。

圖1 各組口腔黏膜組織HE染色(×400)

2.2各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較 空白對(duì)照組CD4+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值均明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組和SOD組，而CD8+T淋巴細(xì)胞明顯少于陽(yáng)性對(duì)照組和SOD組(P<0.05)；SOD組CD4+T淋巴細(xì)胞和CD4+/CD8+比值較陽(yáng)性對(duì)照組顯著升高，而CD8+T淋巴細(xì)胞較陽(yáng)性對(duì)照組顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組血清TNF-α、IL-1及IL-2比較 空白對(duì)照組TNF-α、IL-6和IL-8均明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組和SOD組(P<0.05)；SOD組TNF-α、IL-6和IL-8較陽(yáng)性對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較：2)P<0.05；表2同

表2 各組外周血TNF-α、IL-6和IL-8比較

3 討 論

RAU發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，患者免疫功能降低或亢進(jìn)等免疫功能異常，基因決定的遺傳基礎(chǔ)，胃潰瘍、十二指腸潰瘍等消化系統(tǒng)疾病，其他疾病合并的感染及心理壓力、工作生活環(huán)境等環(huán)境因素都會(huì)引起發(fā)作，研究證實(shí)〔6～8〕，除上述因素外還有其他原因可導(dǎo)致RAU發(fā)生，生物體體內(nèi)氧自由基的增多可導(dǎo)致其頻繁發(fā)作〔9〕。自由基是帶電荷的原子或原子團(tuán)〔10〕，動(dòng)物體內(nèi)以氧自由基存在為主包括：超氧陰離子自由基(O2-)、羥基自由基(-OH)和過(guò)氧化氫(H2O2)，氧自由基活性極強(qiáng)容易參與反應(yīng)搶奪電子，紫外輻射、添加劑、環(huán)境污染等外部因素及新陳代謝均會(huì)產(chǎn)生氧自由基〔11〕。正常生理狀態(tài)下，氧自由基的清除與產(chǎn)生保持動(dòng)態(tài)平衡，病變時(shí)氧自由基不能被及時(shí)清除，可與周圍組織的大分子搶奪電子，破壞細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、DNA和RNA〔12〕，膠原蛋白變性使病變部位交聯(lián)，致使組織發(fā)生病理改變，引起細(xì)胞損傷、衰老、非正常死亡甚至癌變〔13,14〕。SOD是生物體內(nèi)一種生物活性物質(zhì)也是重要的抗氧化酶，可清除生物體新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，最為重要的是它可清除氧自由基，起到保護(hù)機(jī)體的作用〔15〕。