灰樹花多糖及其復合多糖對肺纖維化大鼠的作用

張立霞 林緒濤 李 軍 楊 靜 李 琳 趙 敏 倪艷波

(濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 264003)

肺纖維化活動性進展具有隱蔽性，預后很差，患者往往因為呼吸衰竭導致死亡。肺纖維化的常規(guī)治療可以延遲肺纖維化患者的病程進展時間，但很難從根本上治愈肺纖維化〔1〕。本研究用博來霉素氣管內(nèi)注射制作較符合肺纖維化病理發(fā)展過程的肺纖維化模型，使用非常規(guī)食藥兩用患者多糖預干預提高動物機體的抵抗力及免疫調(diào)節(jié)能力，觀察其能否在肺纖維化的發(fā)展過程中起到較好的抵制作用。肺纖維化具有一定的遺傳因素和高危人群，如長期接觸粉塵、煤塵等的人群，如果灰樹花多糖能通過改善抵抗力和免疫功能，對肺纖維化的發(fā)生及進展有抵制作用，將是一種較好的預防手段。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器 SD大鼠，雄性，體重180～200 g，購自煙臺綠葉科技有限公司，隨機分為模型組、灰樹花多糖組、灰樹花復合多糖組，每組20只。灰樹花多糖：購自浙江方格；博來霉素：日本化藥株式會社，批號：Y20262；波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、免疫熒光抗體二抗：武漢博士德生物工程有限公司；倒置顯微鏡，奧林巴斯株式會社；激光共聚焦掃描顯微鏡，德國萊卡；IX71倒置熒光顯微鏡，奧林巴斯株式會社。

1.2實驗方法

1.2.1肺纖維化大鼠模型的建立 SD大鼠適應性飼養(yǎng)1 w，4%水合氯醛以1 ml/100 g腹腔注射進行麻醉，腹部朝上固定在大鼠操作臺上，將脖頸處的毛發(fā)剃除暴露皮膚，75%乙醇及碘伏消毒皮膚，手術(shù)刀切開皮膚，用眼科剪刀及鑷子小心地剝除氣管上肌肉、筋膜、脂肪等組織暴露氣管，將氣管剪開一個V形小口，插入注射器針頭，將博來霉素以5 mg/kg注射入大鼠氣管內(nèi)，拍打、搖晃大鼠使氣管內(nèi)的博來霉素分散至肺部各區(qū)域。

1.2.2灰樹花多糖給藥 將1 g灰樹花多糖/灰樹花復合多糖加入50 ml生理鹽水內(nèi)制成灰樹花多糖/灰樹花復合多糖溶液，以1 ml/100 g灌胃給藥。在制作肺纖維化大鼠前預給藥7 d。

1.2.3Aschcroft評分 在光鏡下對HE染色組織切片病灶纖維化程度半定量分析，將組織纖維化程度分為0～8級。將每個樣本隨機選30個視野進行評分，取所有視野評分值的均數(shù)作為該樣本纖維化的程度評分。具體標準如下：0級，肺組織正常；1級，細支氣管和肺泡壁輕度纖維化；3級，細支氣管和肺泡壁中度纖維化，但無明顯的肺組織結(jié)構(gòu)破壞；5級，明顯纖維化伴有肺組織結(jié)構(gòu)破壞和纖維條帶或纖維小結(jié)節(jié)形成；7級，嚴重肺組織結(jié)構(gòu)變形或出現(xiàn)大面積纖維灶；8級，整個視野全部出現(xiàn)纖維化病灶；位于兩奇數(shù)間者即為相應偶數(shù)級。結(jié)果判斷：每個樣本隨機選30個視野進行評分，取所有視野評分值的均數(shù)作為該樣本纖維化程度評分。

1.2.4Masson染色 步驟：中性甲醛固定組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟入水，Masson復合染色液染色5 min，0.2%醋酸水溶液沖洗，5%磷鎢酸染色10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，苯胺藍染色5 min，0.2 %醋酸水溶液水洗2次，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Masson染色根據(jù)染料分子大小的不同染色，將膠原纖維染成藍色，肌纖維等染成紅色。

1.2.5波形蛋白及α-SMA免疫熒光染色 激光共聚焦顯微鏡觀察。免疫熒光染色步驟為中性甲醛固定組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，石蠟切片，常規(guī)脫蠟入水，熱抗原修復，10%羊血清封閉30 min，甩掉封閉液不沖洗加稀釋好的一抗4℃冰箱過夜后37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h，0.01%磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，加入稀釋好的二抗放入37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min，0.01% PBS沖洗3遍，中性甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行析因分析。

2 結(jié) 果

2.1灰樹花多糖對肺纖維化大鼠死亡率的影響 灰樹花多糖組在前期能降低肺纖維化大鼠的死亡率，但后期大量死亡，并未降低肺纖維化大鼠的總死亡率(表1)。

表1 各組大鼠的死亡數(shù)目(n,n=17)

2.2灰樹花多糖對肺纖維化大鼠生存狀態(tài)的影響 造模6 w后，灰樹花多糖及灰樹花復合多糖組大鼠毛發(fā)光澤，活動活躍，但仍有呼吸急促，咳嗽，有時可見鼻出血，證明大鼠肺部損傷仍較嚴重。模型組大鼠毛發(fā)粗糙，活動遲緩，呼吸急促，咳嗽，可見鼻血。

2.3灰樹花多糖對大鼠體重的影響 各時點，各組大鼠體重比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 各組大鼠體重比較

2.4灰樹花多糖對大鼠肺臟損害的影響 與模型組比較，灰樹花多糖及灰樹花復合多糖組大鼠肺臟標本HE染色后Aschcroft評分分別為(5.80±1.58)、(5.63±2.13)分，與模型組〔(5.57±2.13)分〕差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5各組肺臟組織形態(tài)學觀察 灰樹花多糖組、灰樹花復合多糖組及模型組肺臟標本，HE染色后均可見大面積肺纖維化結(jié)節(jié)灶，結(jié)節(jié)灶內(nèi)肺臟正常結(jié)構(gòu)消失，纖維組織增生，可見典型的成纖維細胞，細胞體積較大，胞質(zhì)紅染，細胞核大。Masson染色顯示纖維化結(jié)節(jié)灶中可見大量的膠原纖維增生(圖1)。

圖1 各組肺臟標本HE染色及Masson染色(×400)

2.6各組肺臟組織纖維化相關(guān)蛋白表達比較 激光共聚焦下觀察發(fā)現(xiàn)，各組標本均有大量纖維灶，波形蛋白及α-SMA的表達無明顯變化，較正常的肺臟組織處兩種蛋白的表達較弱，纖維灶處波形蛋白及α-SMA高表達(圖2)。

圖2 各組肺臟波形蛋白及α-SMA免疫熒光染色(×400)

3 討 論

隨著真菌多糖純化工藝的提高及對其的研究越來越多，人們對真菌多糖的認識和接受度也越來越高，香菇多糖、灰樹花多糖、茯苓多糖及猴頭菇多糖等多種真菌多糖已應用于臨床。目前，香菇多糖，灰樹花多糖仍是研究及使用較廣泛的兩種真菌多糖，其主要功能是作為免疫調(diào)節(jié)劑及對抗癌的輔助藥物〔2～4〕。國內(nèi)外實驗研究表明，從灰樹花子實體提取的多糖具有抗腫瘤作用,并有一定預防腫瘤的效果，目前對于抗腫瘤的研究主要集中在卵巢癌、乳腺癌等，對于肺損傷的研究相對較少〔5，6〕。本研究在前期工作對大劑量灰樹花多糖使用的安全性進行了評估，并確定了最佳的給藥劑量〔7〕。復合多糖是指對不同種類的活性真菌多糖進行高度濃縮、提純、復壯而成的系統(tǒng)真菌多糖營養(yǎng)，各真菌多糖之間的營養(yǎng)、藥理作用呈現(xiàn)協(xié)同性〔8〕。相比單一的真菌多糖，復合真菌多糖具有的生理活性和保健功能更全面，本研究采用以灰樹花多糖為主，佐以香菇多糖、云芝多糖及甘草酸，其免疫調(diào)節(jié)功能要優(yōu)于灰樹花多糖單獨使用。

本實驗研究選用用大鼠氣管內(nèi)注射博來霉素來制作大鼠的肺纖維化模型〔9〕，這一模型是較接近肺纖維化病理過程的實驗動物模型，早期肺泡炎，間質(zhì)性肺炎，肺泡上皮受損，成纖維細胞增生，巨噬細胞、中性粒細胞等炎性浸潤，由此導致細胞外基質(zhì)成分在肺泡和間質(zhì)內(nèi)沉積及纖維組織的過度修復造成的肺組織結(jié)果的紊亂，肺實質(zhì)損傷，慢性肺纖維增生，肺間質(zhì)纖維化，膠原沉積，肺泡結(jié)構(gòu)改變，最終發(fā)生肺纖維化，其病理發(fā)展與人的肺纖維化進展相似。

本研究發(fā)現(xiàn)灰樹花多糖及復合多糖并沒有提高肺纖維化大鼠的最終生存率及肺臟結(jié)構(gòu)的損傷但可以改善其生存狀態(tài)，對博來霉素造成的大鼠肺部變化也無明顯的改善。

通過對灰樹花多糖及其復合多糖在肺纖維化大鼠的作用預測，在肺纖維化患者中或肺癌患者中使用灰樹花多糖可以改善其基本狀況，但不能作為治療藥物單獨使用，具體情況需要經(jīng)過進一步實驗研究。