天門冬地上部分水提液在小鼠衰老過程中的抗氧化作用

袁祎玲 殷浩宇 譚 娟

(懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，湖南 懷化 418008)

天門冬是我國傳統(tǒng)的藥用植物〔1,2〕。現(xiàn)代藥理研究表明，天門冬不僅具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心等功效，在抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老等方面均有顯著藥效〔3〕。天門冬傳統(tǒng)的藥用部位主要是地下塊狀根，但地上部分莖、葉鮮重比重占整株的40%以上?，F(xiàn)代研究表明，根據(jù)植物遺傳規(guī)律及次生代謝產(chǎn)物的分布規(guī)律，其藥用成分往往不只分布于單一器官〔4〕，白術(shù)〔5〕、人參〔6〕等傳統(tǒng)藥用部位為根莖或鱗莖等地下部分，其地上部分有效成分也非常豐富甚至個(gè)別成分含量超過根的含量。另外，紫萁、蒺藜等傳統(tǒng)藥用植物的非藥用部位與藥用部位具有相同或相近的藥用功效〔7,8〕。本實(shí)驗(yàn)擬分析天門冬地上部分水提液對(duì)D-半乳糖致小鼠衰老過程中的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 參考譚娟等〔9〕研究，將天門冬地上部分(莖和葉)60℃烘干后，粉碎成粗粉。取20 g，加水160 ml煮提3次，1 h/次，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，蒸餾水稀釋到生藥濃度0.1 g/ml，高壓蒸汽滅菌后冷藏備用。參照中國藥典〔1〕，按20倍成人用藥劑量，給小鼠灌胃高濃度天門冬(4.0 g/kg體重)。D-半乳糖，上海試劑二廠；維生素C(Vc)，華中藥業(yè)；0.9%NaCl注射液，杭州民生藥業(yè)；Bouin固定液；其余試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用KM小鼠，雌、雄各30只，體重維20 g，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院(合格證號(hào)：湘檢證字2008-0002)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Mettler-ToledoAL104電子天平，瑞士；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海；LeicaRM2255切片機(jī)，德國；Olympus BX-53，日本。

1.4模型制備 60只KM小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，各組分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)水，每組連續(xù)給藥30 d。正常對(duì)照組皮下注射0.9%生理鹽水(100 mg/kg)；模型組以D-半乳糖(100 mg/kg)為陽性對(duì)照；Vc組注射D-半乳糖的同時(shí)灌胃Vc(100 mg/kg)；給藥組分為低、中、高濃度組，注射D-半乳糖同時(shí)分別按1.0、2.0和4.0 g/kg體重灌胃天門冬地上部分水提液。

1.5生化指標(biāo)測(cè)定 末次給藥24 h后，摘取小鼠眼球，第一滴血棄之，其余血置于有肝素鈉的eppendorf管(肝素2 U/μl，取5 μl濕潤管壁)中，3 000 r/min離心10 min，取上清分別測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)合成酶(NOS)、氧化氫酶(CAT)、NO和丙二醛(MDA)。斷頸處死，取肝，預(yù)冷生理鹽水分別制成1%和10%勻漿，1 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)以上各項(xiàng)指標(biāo)。試劑均采用南京建成生物工程研究所試劑盒。

1.6組織病理學(xué)觀察 斷頸處死后，迅速取其心、肝、脾、肺、腎、胰等臟器，Bouin液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片5～7 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微觀察，OLYMPUS BX53拍照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠血清、肝臟生化指標(biāo)的影響 相比模型組，低、中、高濃度組血清NOS、CAT、SOD及NO含量顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.05)，且隨著給藥濃度的增加，SOD、NOS、CAT活性增強(qiáng)，中濃度組和高濃度組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高濃度組SOD、NOS、CAT與Vc組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高濃度組肝臟SOD、NOS、CAT及NO含量分別比模型組高11.36%、47.30%、12.40%、139.80%，MDA含量比模型組低26.53%(P<0.05)；NOS活性顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 天門冬地上部分水提液對(duì)D-半乳糖致衰小鼠血清、肝臟生化指標(biāo)的影響

與模型組比較：1)P<0.05；與正常對(duì)照組比較：2)P<0.05

2.2天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠肺顯微結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組細(xì)支氣管管壁平整，肺泡壁薄，排列整齊。模型組注射D-半乳糖后組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，細(xì)支氣管管壁明顯增厚，肺泡間隔顯著增寬，肺泡壁纖維組織有增生，毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血。低濃度組細(xì)支氣管管壁仍有少量增厚現(xiàn)象，肺泡間隔相比模型組明顯變薄，偶見毛細(xì)血管擴(kuò)張充血。中濃度組和高濃度組各組織結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)，尤其是高濃度組，肺泡壁薄，肺泡囊形態(tài)規(guī)整，與正常對(duì)照組形態(tài)無明顯差異，見圖1。

圖1 天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠肺組織的影響(HE,×10)

2.3天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠心臟顯微結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組心肌纖維排列緊密，層次分明。模型組心肌纖維結(jié)構(gòu)模糊，腫脹扭曲，心肌間質(zhì)毛細(xì)血管明顯充血。灌胃不同濃度天門冬地上部分水提液，心肌纖維結(jié)構(gòu)改善明顯，隨濃度增加結(jié)構(gòu)更加清晰完整，高濃度組與正常對(duì)照組形態(tài)結(jié)構(gòu)極為接近，見圖2。

圖2 天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠心臟的影響(HE，×40)

2.4天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠脾臟顯微結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組脾臟紅髓和白髓分界明顯，淋巴細(xì)胞緊密分布。模型組紅髓、白髓分界不清晰，淋巴細(xì)胞分布疏松，數(shù)量顯著減少。灌胃天門冬地上部分水提液后，紅髓白髓界限逐漸清晰，白髓區(qū)淋巴細(xì)胞分布由較松散逐漸緊密，密度顯著增加，紅髓區(qū)紅細(xì)胞逐漸豐富，見圖3。

2.5天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞核較大，沿肝細(xì)胞索緊密排列。模型組肝細(xì)胞明顯腫脹，排列紊亂，肝板間間隙變寬，中央靜脈及肝血竇間均可見炎癥細(xì)胞浸潤。天門冬各濃度組隨濃度升高肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸趨向正常，尤其是高濃度組肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富，細(xì)胞排列緊密，見圖4。

圖3 天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠脾組織的影響(HE，×20)

圖4 天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠肝組織的影響(HE,×20)

2.6天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠腎臟和胰臟顯微結(jié)構(gòu)的影響 天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠腎和胰臟組織結(jié)構(gòu)保護(hù)效果不顯著。模型組腎小球萎縮，腎小囊囊腔明顯擴(kuò)大，腎小管管腔內(nèi)偶見蛋白管型；胰臟部分胰島細(xì)胞空泡化，分泌腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊。相比模型組，低濃度組仍有部分病變現(xiàn)象，高濃度組結(jié)構(gòu)得到改善，見圖5，圖6。

圖5 天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠腎臟的影響(HE,×20)

圖6 天門冬地上部分水提液對(duì)小鼠胰臟的影響(HE,×20)

3 討 論

活性氧是細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)傳導(dǎo)分子，特別是神經(jīng)細(xì)胞。在外界環(huán)境誘發(fā)下，活性氧增加，抗氧化酶能有效清除過量活性氧，維持體內(nèi)活性氧均衡，有效維護(hù)生物體的健康〔10〕?？寡趸到y(tǒng)酶含量的變化直接反映生物體的損傷程度和修復(fù)情況。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，可催化生物體內(nèi)的超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，降低自由基代謝產(chǎn)物MDA的生成〔11〕。CAT是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，能清除SOD歧化超氧陰離子自由基產(chǎn)生的過氧化氫，主要存在于動(dòng)物肝臟和血液中〔12〕。NO是體內(nèi)重要的信使分子，對(duì)維持血管張力恒定、調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)定、殺菌均有重要作用，也是重要的神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)分子，NO的生成量與NOS的活性密切相關(guān)〔13〕。MDA是脂質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，體外影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體關(guān)鍵酶活性，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性〔14,15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明天門冬地上部分能夠提高體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活性，有利于減少機(jī)體過氧化損傷程度。

已有報(bào)道，天門冬塊根提取液對(duì)小鼠衰老過程中的臟器顯微結(jié)構(gòu)損傷有一定抑制作用，抑制效果最佳的是脾和肺，其次是心和胰〔9〕。據(jù)記載，天門冬地下部分即塊根具有養(yǎng)陰潤燥，清肺生津的作用〔1〕。天門冬塊根化學(xué)成分種類較多，除氨基酸、糖類之外，富含維生素、黃酮等成分〔16〕。本研究推測(cè)天門冬地上部分也有與塊根類似的有效成分，同樣具有提高抗氧化系統(tǒng)酶活性，降低脂質(zhì)過氧化，改善體內(nèi)臟器形態(tài)結(jié)構(gòu)等功能。