檸條組織培養(yǎng)體系的建立

楊俊鸞

（山西省林木育種研究中心，山西 太原 030031）

檸條（Caragana intermedia）為豆科錦雞兒屬（Caragana）落葉大灌木，適于生長在海拔約900～1 300 m的陽坡、半陽坡，它耐寒、耐旱、耐高溫，是干旱草原、荒漠地帶的旱生灌叢[1-4]。目前，檸條已經(jīng)成為我國華北、西北及東北西部的固沙造林和水土保持的重要樹種之一，是優(yōu)良的固沙和綠化荒山植物[5-7]，可作飼草飼料[8-11]。同時(shí)，它的根、花、種子均可入藥[12-14]，對滋陰養(yǎng)血、通經(jīng)、鎮(zhèn)靜及殺蟲等有良好效果[15-17]。

檸條傳統(tǒng)的繁殖方式主要為種子繁殖，但檸條苗木容易受溫度、濕度、地形、地勢、病蟲害等因素的影響，表現(xiàn)為出苗率不高、出苗不整齊等現(xiàn)象[18-19]。但隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展，檸條植被在生態(tài)建設(shè)中越來越受到重視，以至于檸條苗木供不應(yīng)求的矛盾日漸突出。

為了滿足市場對檸條的需求，在實(shí)際生產(chǎn)中降低育苗成本，故對檸條進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究。本研究選用檸條莖段作為外植體，KF/MS作為基本培養(yǎng)基加不同比例的激素進(jìn)行組織培養(yǎng)，對檸條莖段愈傷組織誘導(dǎo)，并進(jìn)行芽分化、芽的繼代增殖和生根培養(yǎng)，產(chǎn)生新的植株。通過研究其最佳的培養(yǎng)條件，旨在獲得一套高效的檸條組織培養(yǎng)體系，為今后工廠化育苗奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用當(dāng)年生的檸條嫩枝作為外植體，檸條嫩枝采自山西省林木育種研究中心的苗圃地，剪取當(dāng)年生無病蟲害處于生長旺盛期的檸條嫩枝作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒方法和初代接種 選取當(dāng)年生的檸條嫩枝用流水沖洗干凈，將其剪成2 cm左右的莖段（一般要求保留2個(gè)左右的腋芽），放入燒杯中，在流水的環(huán)境下沖洗30 min，然后用75%的乙醇浸泡搖晃20～25 s，將材料一分為二，一份用0.1%氯化汞浸泡6～8 min，另一份用2%的次氯酸鈉浸泡6～8 min。浸泡中不斷用消毒鑷子攪拌，使外植體充分消毒，然后用無菌蒸餾水沖洗4～5次，即可對莖段進(jìn)行初代接種，每瓶放1塊外植體，接種15 d后統(tǒng)計(jì)污染數(shù)，查看消毒效果。

1.2.2 培養(yǎng)基的選擇和培養(yǎng)條件 檸條繁殖采用KF，MS，1/2 MS為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為LED燈光照培養(yǎng)，光照時(shí)間12 h，光照強(qiáng)度為2 000 lx，溫度（25±2）℃，濕度70%～80%。

1.2.3 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素濃度的選擇 KF和MS基本培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量濃度的6-BA（0.5，0.8，1.0 mg/L）和 NAA（0.3，0.5 mg/L），接種 30 d后，觀察2種培養(yǎng)基中莖段誘導(dǎo)不定芽分化的情況。

1.2.4 叢生芽增殖培養(yǎng)基中激素濃度的選擇 將分化的不定芽分別接種在不同激素（6-BA和NAA）配比的KF和MS培養(yǎng)基中，6-BA有0.6，1.2，1.5mg/L等3個(gè)梯度，NAA有0.2，0.3，0.5 mg/L等3個(gè)濃度梯度，參考資料設(shè)計(jì)最右組合[20]，培養(yǎng)40 d后，觀察不定芽的增殖情況。

1.2.5 根誘導(dǎo)培養(yǎng)基 生根培養(yǎng)基選擇1/2 MS＋NAA0.3mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂7 g/L，并添加不同含量的活性炭，活性炭含量分別為0，0.3，0.5，1.0，2.0 mg/L。當(dāng)誘導(dǎo)苗長至5.0 cm時(shí)，轉(zhuǎn)接于上述不同活性炭含量的生根培養(yǎng)基中，研究其對檸條生根的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑和消毒時(shí)間對外植體消毒效果的比較

外植體消毒的徹底與否直接影響初代的污染率。對于初代培養(yǎng)，雖然外植體進(jìn)行了表面消毒，但污染仍在所難免。為了提高無菌材料的獲得率，提高工作效率，初次接種每瓶一般放1塊外植體。由表1可知，2種不同消毒劑的消毒時(shí)間都為8 min時(shí)，均比消毒6 min的外植體污染率明顯降低。在相同的消毒時(shí)間下，用2%次氯酸鈉處理的外植體污染明顯減少，污染率降低；而用0.1%氯化汞處理的外植體污染率較次氯酸鈉處理高。由此可知，檸條外植體用2%次氯酸鈉消毒效果比較好，消毒時(shí)間以8 min為宜。

表1 不同消毒劑、消毒時(shí)間對檸條外植體消毒效果比較

2.2 不同培養(yǎng)基對檸條莖段誘導(dǎo)不定芽與不定芽生長的影響

接種后的檸條莖段培養(yǎng)30 d后觀察其形成的不定芽數(shù)和生長狀況（表2）。接種于MS培養(yǎng)基上有不定芽的形成，誘導(dǎo)率為50%；1/2 MS培養(yǎng)基接種的莖段只有少量的不定芽生成，誘導(dǎo)率只有16%，而且不定芽生長狀態(tài)較差，主要是由于培養(yǎng)基中大量元素的減少使植物生長所需的各種元素不足所導(dǎo)致；接種于KF培養(yǎng)基上的有大量不定芽生成，誘導(dǎo)率達(dá)到了96%，且長勢良好。所以，選擇KF為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對檸條莖段生成不定芽的影響

2.3 不同激素對不定芽分化的影響

激素種類和激素的濃度顯著影響檸條不定芽的分化效果。在檸條快速繁殖試驗(yàn)中常用的激素有6-BA，NAA，GA3等[20]。本試驗(yàn)用不同濃度的6-BA和NAA加入KF和MS培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)觀察其不定芽的分化以及擴(kuò)繁能力（表3）。以KF為基本培養(yǎng)基，當(dāng) 6-BA為0.8 mg/L，NAA為 0.3 mg/L時(shí)，不定芽分化最多，分化率為82.5%；以MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，不定芽分化率低于KF作為基本培養(yǎng)基的分化率，且分化出的芽顏色為淺綠色，部分芽還有玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生。所以，檸條不定芽分化的最佳培養(yǎng)基是KF＋6-BA 0.8 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋瓊脂7 g/L。

表3 6-BA和NAA組合對檸條不定芽分化的影響

2.4 不同激素配比對叢生芽增殖的影響

以檸條不定芽為試驗(yàn)材料，在KF基本培養(yǎng)基中加入不同的激素配比進(jìn)行試驗(yàn)，對檸條叢生芽分化增殖最佳條件進(jìn)行篩選。培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生的叢生芽數(shù)量（表4）。結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基上叢生芽分化個(gè)數(shù)較少，且萌生慢；KF培養(yǎng)基上叢生芽分化個(gè)數(shù)較同等濃度的MS培養(yǎng)基多，且植株生長健壯，所以，KF是最佳培養(yǎng)基。誘導(dǎo)叢生芽效果較好的激素組合為6-BA1.2 mg/L＋NAA0.3 mg/L。

由上述結(jié)果可知，適合檸條叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基和激素組合為KF＋6-BA 1.2 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋瓊脂7 g/L，增殖率為90%。

表4 檸條莖段叢生芽增殖試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.5 活性炭對檸條試管苗生根的影響

當(dāng)檸條無根苗生長至5 cm左右時(shí)，將其接種至含有不同含量活性炭的生根培養(yǎng)基中。試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基為1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L，經(jīng)過約20 d培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)檸條生根情況。

表5 活性炭對檸條試管苗生根的影響

由表5可知，活性炭含量為0時(shí)，生根率為52%，根系長，但發(fā)根晚，且容易褐化，移栽時(shí)容易傷根；活性炭含量為0.5 g/L時(shí)，生根率為94%，發(fā)根早，且根系好、粗壯，移栽利于成活；活性炭為2 g/L時(shí)，根系短、發(fā)根晚，生根率最低，為46%。這表明活性炭的含量對檸條生根有明顯影響。由此可知，低含量的活性炭不僅能促進(jìn)試管苗的生根，而且又能吸附培養(yǎng)基中的礦物質(zhì)和無機(jī)鹽，改善培養(yǎng)基的透氣性，有利于根的誘導(dǎo)和生長。所以，檸條生根的最適培養(yǎng)基為1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂7 g/L＋活性炭0.5 g/L。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，檸條莖段培養(yǎng)用2%次氯酸鈉浸泡外植體8 min為消毒最佳時(shí)間；誘導(dǎo)愈傷、芽分化和增殖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為KF，愈傷誘導(dǎo)率為96%；芽分化的最佳激素配比培養(yǎng)基為KF＋6-BA 0.8 mg/L＋NAA0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋瓊脂7 g/L；叢生芽繼代增殖培養(yǎng)基為KF＋6-BA 1.2 mg/L＋NAA0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋瓊脂7 g/L，增殖率為90%；生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂7 g/L＋活性炭0.5 g/L，生根率為94%。