鯉科魚類HIF-1的研究進展

韓青青，王 華，李 鑫，曹詣斌

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

在魚類的生存及生長發(fā)育中，水中的溶解氧起著很重要的作用。與空氣中氧含量相比，水中溶解氧含量只有同體積空氣氧含量的3%，所以，與陸生生物相比，水生生物對氧氣的利用率更為重要[1]。由于水體本身溶氧量的特點及外界環(huán)境的影響，使得水體低氧成為自然現(xiàn)象。魚類為適應(yīng)水環(huán)境中溶解氧濃度的波動，已形成了不同的應(yīng)對策略[2]。而作為低氧相關(guān)基因調(diào)控的核心轉(zhuǎn)錄因子的低氧誘導(dǎo)因子HIF-1在魚類低氧應(yīng)答中起著重要的作用。

鯉科魚類是鯉形目中分布最廣、種類也最多的一群，為魚類中最大的一科，約有200多屬2 000多種，都是淡水魚類，分布很廣。我國鯉科魚類中的主要經(jīng)濟魚類有“四大家魚”（青魚Mylopharyngodon piceus、草魚 Ctenopharyngodon idellus、鰱 Hypophthalmichthys molitrix、 鳙 Aristichthys nobilis）、鯉Cyprinus carpio、鯽 Carassius auratus、鳊 Megalobrama terminalis、團頭魴Parabramis pekinensis等，是池塘養(yǎng)魚的主要對象。其中，作為重要的模式生物，人們廣泛采用斑馬魚來研究低氧對胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答和代謝調(diào)節(jié)等的影響。同時，鯽魚和金魚是低氧耐受能力最強的淡水魚類之一，是迄今唯一一種能在室內(nèi)不依賴氣泵而長期生存的魚類，擁有一系列獨特的低氧適應(yīng)生理機制，例如，可通過乙醇脫氫酶（Acetaldehyde Dehydrogenase，ADH）將無氧呼吸產(chǎn)生的乳酸轉(zhuǎn)化為乙醇，然后從鰓部排出，避免了長期無氧呼吸可能導(dǎo)致的酸中毒[3]；金魚鰓部組織也具有常氧和低氧狀態(tài)下進行結(jié)構(gòu)可塑性轉(zhuǎn)化的能力[4-5]。鑒于HIF-1在動物低氧應(yīng)答中所發(fā)揮的重要作用，有必要對目前鯉科魚類HIF-1的研究背景與進展進行闡述。

1 低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）的發(fā)現(xiàn)、調(diào)節(jié)及其在鯉科魚類中的克隆

在肝癌細胞株Hep3B細胞低氧處理后的核提取物中，WANG等[6]發(fā)現(xiàn)了一種能與紅細胞生成素基因增強子特異性地結(jié)合的蛋白質(zhì)，由于它廣泛存在于缺氧細胞內(nèi)，命名為低氧誘導(dǎo)因子（HIFs）。HIFs能特異性地與其靶基因調(diào)控區(qū)的低氧應(yīng)答元件結(jié)合，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進機體和細胞對低氧環(huán)境的適應(yīng)。

低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）是HIF-1α和HIF-1β 2種亞基組成的具有轉(zhuǎn)錄活性的異二聚體，HIF-1α的分子量為120kD，HIF-1β的分子量為91～94 ku。其中，α亞基受到氧濃度的調(diào)控，是低氧誘導(dǎo)因子的調(diào)節(jié)亞基。而β亞基則持續(xù)性表達，不受氧濃度的影響，2種亞基的N端均含有bHLH/PAS同源區(qū)，對于二聚化和與靶基因表達調(diào)控區(qū)的結(jié)合是必需的[7]。在HIF-1α亞基中部存在一個氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域（Oxygen-Dependent Degradation Domain，ODDD）；C-末端包括2個反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD），即TAD-N和TAD-C[8]。目前，針對HIFs的研究主要在HIF-α上，哺乳動物體內(nèi)一共發(fā)現(xiàn)3種HIF-α亞基，HIF-1α，HIF-2α以及HIF-3α[9]（圖1），HIF-1α和HIF-2α具有48%的氨基酸序列一致性，并且可以識別相同的DNA結(jié)合區(qū)域，但是又具有各自獨特的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，HIF-2α參與長期慢性缺氧，而HIF-1α與急性缺氧有關(guān)[10]，HIF-3α只在高血管組織如眼角膜中表達。

在常氧的情況下，HIF-α亞基的半衰期很短，細胞不斷合成和降解蛋白質(zhì)。氧濃度對α亞基降解的調(diào)控是通過ODDD域中2個脯酰胺殘基（Pro402和Pro564）的羥基化實現(xiàn)的。羥基化反應(yīng)由脯酰胺羥化酶（prolyl hydroxylase，PHDs）催化，活性取決于氧、2-酮戊二酸和輔因子Fe2+的水平。脯氨酸的羥基化使HIF-α亞基與腫瘤抑制基因蛋白（von Hippel-Lindau tumor suppressor，pVHL）相互作用，并通過泛素蛋白酶體通路被降解[11]。在氧濃度下降時，脯氨?；u基化受到抑制，穩(wěn)定的HIF-1α向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移并與HIF-1β形成HIF-1二聚體，然后與目的基因表達調(diào)控區(qū)域的低氧應(yīng)答元件結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達[12-13]。Pro402和Pro564在魚類HIF-1α中保守，推測這種調(diào)節(jié)機制也同樣存在于鯉科魚類中。

關(guān)于HIF的研究目前在哺乳動物中比較深入，同時在魚類包括在一些鯉科魚類中也展開了初步研究，如魚類HIF-1α序列特征最早在草魚[14]、斑馬魚（Barchydanio rerio var）[15]、青海裸鯉（Gymnocypris przewalskii）[16]、團頭魴（Megalobrama amblycephala）[17]等魚中相繼報道。而HIF-2α基因在斑馬魚、草魚等魚中也有一定的研究[18]。

2 低氧對鯉科魚類HIF-1及其靶基因的影響

斑馬魚作為鯉科魚類的模式動物，人們對低氧誘導(dǎo)斑馬魚胚胎HIF-1的表達，HIF-1及其靶基因啟動子的鑒定等展開了研究。常氧環(huán)境中，在斑馬魚胚胎的不同發(fā)育階段均可檢測到HIF-1α蛋白，但各階段之間沒有顯著差異，而HIF-2α和HIF-3α在孵化后期水平比前期顯著上升；低氧處理使HIF-1α蛋白水平明顯上升，而HIF-2α和HIF-3α蛋白不受影響，表明HIF-2α和HIF-3α在早期發(fā)育中更為重要，而HIF-1主要參與低氧應(yīng)答[19]。在斑馬魚胚胎發(fā)育中進行低氧或完全缺氧處理會激活HIF-1途徑，并在幼魚期表現(xiàn)出較高的低氧耐受能力，同時導(dǎo)致在魚群中雄魚占較高比例[20]。WANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TET1蛋白作為TET（teneleventranslocation）家族的甲基胞嘧啶雙加氧酶的一員，對于斑馬魚和小鼠的低氧耐受不可或缺。Tet1缺陷型斑馬魚和小鼠與野生型相比，對低氧更為敏感。Tet1采用不同的方式促進HIF-α的穩(wěn)定性并增強其轉(zhuǎn)錄激活活性，Tet1競爭性地抑制PHD2與HIF-2α的結(jié)合，降低HIF-2α的羥化水平；相反，Tet1并不影響HIF-1α的羥化，而是通過對HIF-1α C-末端賴氨酸的修飾提高其穩(wěn)定性。

低氧還通過HIF-1影響斑馬魚對銅污染，以及巨噬細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用。在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中，常氧下采用HIF羥化酶的抑制劑DMOG處理，HIF的穩(wěn)定性顯著提高并降低了銅毒性[22]。巨噬細胞在發(fā)育和病理性血管生成中與內(nèi)皮細胞相互作用，但其分子機制并不清楚。斑馬魚中HIF-1α突變導(dǎo)致血管生成和血管修復(fù)缺陷，使得巨噬細胞從主動脈-性腺-中腎（AGM）的動員被削弱[23]。轉(zhuǎn)錄組分析低氧處理的斑馬魚VHL突變胚胎，檢測到許多在人類低氧細胞模型中被激活的關(guān)鍵低氧應(yīng)答基因，但同時抑制許多脂類代謝相關(guān)基因的表達[24]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理顯著增高斑馬魚HIF-1α的mRNA水平，并在處理8 h后達到峰值，推測LPS與低氧協(xié)同調(diào)節(jié)斑馬魚HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平[25]。

除了斑馬魚以外，在其他鯉科魚類如鯽魚、草魚、武昌魚和裸鯉等中，人們也對HIF-1及其靶基因在低氧環(huán)境中表達展開了研究。在鯽魚鰓組織中，HIF-1α蛋白在常氧環(huán)境也保持一定水平，而低氧導(dǎo)致HIF-1α更加穩(wěn)定，但HIF-1靶基因iNOS mRNA水平?jīng)]有顯著差異[26]。Northern blot分析顯示，低氧誘導(dǎo)草魚腎臟HIF-1α mRNA水平的上升，并在眼睛、鰓、心臟、腎和肝組織中誘導(dǎo)HIF-4α mRNA水平的上升。Western blot分析表明，內(nèi)源HIF-1α和HIF-4α蛋白水平均同樣受低氧誘導(dǎo)，推測草魚HIF-1α和HIF-4α在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平受到不同方式的調(diào)節(jié)[27]。低氧誘導(dǎo)草魚肝臟和腎臟CITED1，CITED3a和CITED3b mRNA水平顯著上升，熒光素酶報告基因表明，HIF-1激活這3個基因的啟動子。CHIP分析顯示，常氧與低氧中肝臟與腎臟組織這3個基因啟動子與HIF-1的結(jié)合存在顯著差異。同時CITED1，CITED3a和CITED3b對HIF-1的轉(zhuǎn)錄激活活性具有負反饋抑制作用[28-29]。在武昌魚中，低氧處理使HIF-2α mRNA水平在肝臟和腎臟中分別上升了910%和320%，同時HIF-1α mRNA水平在相應(yīng)組織中沒有明顯變化[17]。在青海湖裸鯉不同組織中，HIF-1α的靶基因Glut-1 mRNA水平與低氧處理時間具有相關(guān)性[16]。在普通鯉魚中，肌紅蛋白基因啟動子中存在HRE元件，這一特征解釋了低氧在非肌肉組織中誘導(dǎo)mb-1基因表達的現(xiàn)象。但在mb-2基因中，有一段10 bp序列插入到上游激活因子（upstreamstimulatoryfactor，USF）結(jié)合位點中。由于USF是HIF的一個輔助轉(zhuǎn)錄因子，從而可能導(dǎo)致mb-2對低氧不產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[30]。

3 溫度和重金屬對鯉科魚類HIF-1的影響

3.1 溫度

在鯽魚中，為了研究HIF-1的功能是否參與了與溫度適應(yīng)相關(guān)的基因表達變化以及在低溫適應(yīng)中的作用，RISSANEN 等[31]在 8，18，26 ℃研究了常氧和低氧（0.7 mg/L）條件下HIF-1 DNA結(jié)合活性和HIF-1α表達，結(jié)果表明，HIF-1活性隨著溫度的下降而增加，甚至比對氧濃度的降低更加敏感，顯示體溫和缺氧之間的相互作用調(diào)節(jié)鯽魚HIF-1的功能。

3.2 重金屬

ZIZZA等[32]將鯽魚暴露在亞致死濃度（1.45mg/L）和較低濃度（0.3 mg/L）的CuCl2中，對HSP90及HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平進行了檢測，結(jié)果表明，銅誘導(dǎo)HSP90的下調(diào)和HIF-1α的上調(diào)，這可能與魚類中金屬誘導(dǎo)損傷的修復(fù)有關(guān)。KWONG等[33]研究證明，在斑馬魚中，低氧會抑制斑馬魚對Ca2+的吸收，是通過HIF-1介導(dǎo)的上皮鈣離子通道表達的影響。FITZGERALD等[22]發(fā)現(xiàn)低氧和常氧條件下銅對于斑馬魚的影響存在顯著差異。在常氧條件下，暴露于0.07 mg/L Cu導(dǎo)致斑馬魚死亡率為75.5%，而在低氧條件下，沒有發(fā)生銅誘導(dǎo)的致死效應(yīng)。在20 μmol/LDMOG存在下，在常氧下0.07mg/LCu處理的死亡率為0，這說明HIF通路的激活使銅金屬的毒性顯著降低。KHATIB等[34]在斑馬魚魚鰭再生期間將魚暴露于CoCl2后，觀察到再生魚鰭非常脆弱并且容易裂縫，導(dǎo)致魚在水中活動時容易發(fā)生魚鰭部分或全部損失，這是由于正常的魚鰭再生需要軟骨內(nèi)骨化，也就是軟骨停止增殖，而氯化鈷處理導(dǎo)致HIF水平上升，而HIF促進軟骨繼續(xù)增殖，使得軟骨不會內(nèi)骨化，導(dǎo)致再生鰭脆弱。