LC-MS/MS法測定遺傳毒性雜質(zhì)9-丙烯基腺嘌呤

王秀珍，張治云，宋永保，楊海霞*

（1. 山東省藥學科學院，山東 濟南 250101；2. 山東省化學藥物重點實驗室，山東 濟南 250101；3. 山東海佑福瑞達制藥有限公司，山東 臨沂 276700）

富馬酸替諾福韋二吡呋酯是一種新型開環(huán)膦酸核苷類化合物（ANP），是替諾福韋的前體藥物[1]，可有效對抗多種病毒，是治療艾滋病、乙型肝炎的重要藥物[2-5]。9-丙烯基腺嘌呤（結(jié)構(gòu)式見圖1）是富馬酸替諾福韋二吡呋酯在合成過程中由起始原料替諾福韋引入或在貯存過程中降解產(chǎn)生的遺傳毒性雜質(zhì)，須嚴格控制含量。目前文獻報道9-丙烯基腺嘌呤的含量測定方法多采用LC-MS法[6-10]，有文獻采用單離子模式（SIM）掃描，選擇性較多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式差；有文獻雖采用MRM模式，但或需采用UPLC分離，對儀器要求高；又或?qū)α鲃酉嗪蜕V柱有較高要求。本文建立的LC-MS/MS檢測方法采用HPLC分離，其專屬性、準確度明顯優(yōu)于已報道的方法，可用于富馬酸替諾福韋二吡呋酯中9-丙烯基腺嘌呤的含量測定。

圖1 9-丙烯基腺嘌呤的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

島津LC-20AD高效液相色譜儀（島津儀器公司），AB SCIEX 4000 QTRAP質(zhì)譜儀，Analyst1.6.1數(shù)據(jù)采集與處理軟件（AB公司）。

9-丙烯基腺嘌呤對照品（USP標準品，批號：FOK085，含量：97 %）；乙腈、甲醇（Fisher Scientific公司，色譜純）；乙酸銨（天津科密歐，分析純）；水（杭州娃哈哈，飲用純凈水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相：10 mmol/L醋酸銨：乙腈=65:35（v/v）；柱溫：30 ℃，流速為1.0 ml/min，進樣體積為10 μl。采用電噴霧離子源，MRM模式，正離子掃描方式檢測，檢測離子通道為m/z：176.1/136.1。

2.2 溶液配制

對照品貯備液：精密稱取9-丙烯基腺嘌呤對照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 ml中含0.05 μg溶液。

對照品溶液：精密量取對照品儲備液2 ml置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻（每1 ml中含9-丙烯基腺嘌呤0.01 μg）。

供試品溶液：精密稱取本品適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 ml中含2 mg溶液。

2.3 專屬性試驗

取空白溶劑（甲醇）、對照品溶液、供試品溶液及供試品和對照品的混合溶液按“2.1”項下色譜質(zhì)譜條件依次進樣測定，典型色譜圖見圖2。結(jié)果表明，空白溶劑和供試品溶液對9-丙烯基腺嘌呤測定無干擾，方法專屬性良好。

圖2 9-丙烯基腺嘌呤專屬性試驗的MRM色譜圖

2.4 線性關(guān)系試驗

分別精密量取9-丙烯基腺嘌呤對照品貯備液0.1，0.2，0.4，1.0，2.0，3.0，5.0 ml置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜質(zhì)譜條件依次進樣測定，以9-丙烯基腺嘌呤濃度（C，ng/ml）對峰面積（A）進行線性回歸，得標準曲線方程：A=1335.8C-165.27，r=0.9999，9-丙烯基腺嘌呤在0.49～24.50 ng/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取濃度為9.80 ng/ml對照品溶液按“2.1”項下色譜質(zhì)譜條件連續(xù)進樣6次，9-丙烯基腺嘌呤峰面積的RSD為1.72 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗

按“2.2”項下制備供試品溶液和對照品溶液，室溫下放置，分別于配制后0，1，3，5，8，10，12，24 h按“2.1”項下色譜質(zhì)譜條件進樣測定。結(jié)果供試品溶液在24 h內(nèi)9-丙烯基腺嘌呤峰面積RSD為2.06 %；對照品溶液在24 h內(nèi)9-丙烯基腺嘌呤峰面積RSD為1.94 %。表明供試品溶液和對照品溶液室溫下至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 檢出限和定量限

將9-丙烯基腺嘌呤對照品溶液逐步稀釋，進樣測定，選取信噪比10倍者作為定量限，信噪比3倍者作為檢出限。在進樣量為10 μl時，方法的最低定量濃度為0.49 ng/ml，連續(xù)測定6次峰面積的相對標準偏差（RSD）為3.1 %，最低檢出濃度為0.15 ng/ml。

2.8 重復性試驗

取供試品（批號：090706）6份，按“2.2”項下制備供試品溶液，分別測定，按外標法以峰面積計算樣品中9-丙烯基腺嘌呤的平均含量為0.000 027 %，RSD為1.96 %。

2.9 加樣回收率試驗

取已測定9-丙烯基腺嘌呤含量的富馬酸替諾福韋二吡呋酯樣品（批號：090706）9份，每份20 mg，精密稱定，置入10 ml量瓶，分別加入1.6 ml（80 %），2.0 ml（100 %）和2.4 ml（120 %）濃度為50.55 ng/ml 9-丙烯基腺嘌呤貯備液，每個濃度平行制備3份，分別加甲醇稀釋至刻度，作為回收率試驗溶液，按“2.1”項下色譜質(zhì)譜條件進樣測定，結(jié)果平均加樣回收率為99.18 %，RSD為2.78 %（n=9）。

2.10 樣品測定

取3個批次的富馬酸替諾福韋二吡呋酯樣品（批號：100310，100318，100326），按“2.2”項下制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜質(zhì)譜條件進樣測定，采用外標法以峰面積計算得9-丙烯基腺嘌呤的含量分別為0.000 034 %、0.000 038 %、0.000 042 %。

3 討論

2011年USP官網(wǎng)公布的富馬酸替諾福韋二吡呋酯質(zhì)量標準草案，將9-丙烯基腺嘌呤限度定為5 ppm（0.0005 %），由于其在樣品中的含量特別低，常規(guī)的HPLC法無法檢測，需采用LC-MS/MS法進行檢測。

本方法質(zhì)譜條件中，離子檢測模式采用MRM，質(zhì)譜測得雜質(zhì)9-丙烯基腺嘌呤母離子質(zhì)荷比m/z為176.1，子離子質(zhì)荷比m/z為136.1，選擇離子對為176.1/136.1。MRM與SIM相比，增加了子離子的測定，使方法靈敏度更高，專屬性更強，準確度更高。

實驗采用了不同的流速（0.9，1.0，1.1 ml/min），流動相中鹽與有機相的不同比例（63:37，65:35，67:33），不同的柱溫（27，30，33 ℃）及不同的離子源溫度（500，550，600 ℃），結(jié)果表明，各色譜質(zhì)譜條件變動對9-丙烯基腺嘌呤的測定均無顯著影響。

方法學驗證結(jié)果表明：該方法專屬性強、準確度好、檢測靈敏度高，精密度、線性、穩(wěn)定性等均能滿足測定要求，可用于檢測和控制富馬酸替諾福韋二吡呋酯中的遺傳毒性雜質(zhì)9-丙烯基腺嘌呤的含量。