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    響應(yīng)面法優(yōu)化馬鞭草總黃酮超聲波提取工藝研究及其抗氧化活性考察

    2018-09-11 07:54:56邢佰穎陳田雨楊麗瑩
    食品與藥品 2018年1期
    關(guān)鍵詞:馬鞭草抗壞血酸無(wú)水乙醇

    邢佰穎,陳田雨,楊麗瑩,李 婷,高 鵬

    (山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

    馬鞭草(Verbena officinalisL.)又名土荊芥、鐵馬鞭等,原產(chǎn)于歐洲,主要生長(zhǎng)于原野,在全世界的溫帶至熱帶地區(qū)均有分布。本品具有散瘀通經(jīng)、清熱涼血、解毒消脹、止癢驅(qū)蟲(chóng)的功效[1]?,F(xiàn)代研究表明,馬鞭草主要含環(huán)烯醚萜糖苷類(lèi)、黃酮類(lèi)[2]、三萜類(lèi)、甾醇等化學(xué)成分[3],具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗早孕、調(diào)節(jié)免疫活性等作用[4]。目前對(duì)于馬鞭草的研究報(bào)道并不多見(jiàn),本項(xiàng)目組在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬鞭草總黃酮的超聲波提取工藝并研究其體外抗氧化活性,以期為該藥的研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    UV-1100紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海天美);R201C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義英峪高科儀器廠);循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城);KQ-500E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司);恒溫不銹鋼水浴鍋(上海樹(shù)立);YP10002電子天平(上海光正);JY1002分析天平(上海精密科學(xué)儀器公司);SZ-1型快速混勻器(江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

    1.2 藥品與試劑

    1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,Sigma);蘆丁對(duì)照品(純度:≥98 %,上海源葉,批號(hào):Y01M7S10307);馬鞭草(購(gòu)自安徽亳州中藥材市場(chǎng),經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)萬(wàn)鵬教授鑒定合格);過(guò)氧化氫(天津富宇,批號(hào):20161209);L(+)-抗壞血酸,亞硝酸鈉,三氯化鋁,氫氧化鈉(分析純,國(guó)藥集團(tuán))。

    2 方法

    2.1 馬鞭草總黃酮超聲提取工藝的優(yōu)化

    2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁對(duì)照品5.00 mg,置入25 ml量瓶,加適量無(wú)水乙醇超聲使溶解,以無(wú)水乙醇定容,搖勻,配成0.2 mg/ml的蘆丁對(duì)照品溶液,備用。

    精密移取蘆丁對(duì)照品溶液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 ml,分別置入25 ml量瓶,加無(wú)水乙醇至6 ml,依次加入5 %NaNO2溶液1.00 ml,充分混勻后靜置6 min,加入10 %AlCl3溶液1.00 ml,充分混勻后靜置6 min,最后加入4 %NaOH溶液10 ml,并加無(wú)水乙醇定容至刻度,充分混勻后靜置15 min[5]。以試劑空白為參比溶液,于506 nm處測(cè)各對(duì)照品溶液的吸光度[6]。以蘆丁對(duì)照品質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)建立對(duì)照曲線?;貧w方程為A=0.0916C-0.0148,R2=0.9966,表明蘆丁對(duì)照品溶液在4.00~40.00 μg/ml范圍內(nèi)濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。

    2.1.2 馬鞭草總黃酮提取工藝流程 取馬鞭草段(約為2 cm),準(zhǔn)確稱定,按設(shè)計(jì)好的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行超聲提取,濾過(guò),濾液減壓回收乙醇并繼續(xù)減壓濃縮成稠膏,備用。

    2.1.3 馬鞭草總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

    2.1.3.1 超聲時(shí)間對(duì)馬鞭草總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱取馬鞭草段20 g,固定液料比為30:1,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %,考察超聲時(shí)間分別為10,20,30,40,50,60 min條件下馬鞭草提取物中總黃酮的含量。

    2.1.3.2 液料比對(duì)馬鞭草總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱取馬鞭草段20 g,固定超聲時(shí)間為30 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %,考察液料比分別為10:1,20:1,30:1,40:1,50:1,60:1條件下馬鞭草提取物中總黃酮的含量。

    2.1.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬鞭草總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱取馬鞭草段20 g,固定超聲時(shí)間為30 min,液料比為30:1,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40 %,50 %,60 %,70 %,80 %,90 %條件下馬鞭草提取物中總黃酮的含量。

    2.1.4 超聲法提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化[7]在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以馬鞭草總黃酮的含量(Y)為響應(yīng)值,選取超聲時(shí)間(X1)、液料比(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)為影響因素,采用三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

    表1 馬鞭草總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

    2.2 馬鞭草總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

    2.2.1 馬鞭草總黃酮對(duì)DPPH的清除能力[8]將馬鞭草濃縮液加無(wú)水乙醇配制成濃度分別為5,10,20,40,60,80 μg/ml的樣品溶液。精密移取2 ml樣品溶液于試管中,加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 ml,充分混勻,25 ℃下避光反應(yīng)30 min,以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照,于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,平行測(cè)量3次。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照,精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應(yīng)濃度,按上述方法操作。

    DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對(duì)照]×100 %

    其中:A樣品為樣品溶液2 ml+DPPH溶液2 ml的吸光度;A空白為樣品溶液2 ml+無(wú)水乙醇2 ml的吸光度;A對(duì)照為無(wú)水乙醇2 ml+DPPH溶液2 ml的吸光度。

    2.2.2 馬鞭草總黃酮對(duì)H2O2的清除能力[9]將馬鞭草濃縮液加無(wú)水乙醇配制成濃度分別為5,10,20,40,60,80 μg/ml的樣品溶液。精密移取2 ml樣品溶液于試管中,加入2.5 %的H2O2溶液2 ml,充分混合,靜置15 min,以蒸餾水為空白對(duì)照,于230 nm處測(cè)定其吸光度,平行測(cè)量3次。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照,精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應(yīng)濃度,按上述方法操作。

    H2O2清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對(duì)照]×100 %

    其中:A樣品為樣品溶液2 ml+H2O2溶液2 ml的吸光度;A空白為樣品溶液2 ml+無(wú)水乙醇2 ml的吸光度;A對(duì)照為無(wú)水乙醇2 ml+H2O2溶液2 ml的吸光度。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    3.1.1 超聲時(shí)間的影響 超聲時(shí)間對(duì)提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響見(jiàn)圖1。

    圖1 超聲時(shí)間對(duì)提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響

    由圖1可見(jiàn),在液料比30:1,乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %的條件下,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),馬鞭草總黃酮含量先增加后減小,在40 min時(shí)總黃酮含量最高,40~60 min含量降低。這可能是由于隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),馬鞭草中總黃酮在不斷溶出,在40 min時(shí)提取較完全,再增加超聲時(shí)間會(huì)使黃酮類(lèi)物質(zhì)破壞且增加雜質(zhì)的溶出,降低總黃酮含量。因此,超聲時(shí)間為40min時(shí)最佳。

    3.1.2 液料比的影響 液料比對(duì)提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響見(jiàn)圖2。

    由圖2可見(jiàn),在超聲時(shí)間為30 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %的條件下,隨著液料比的增加,提取物中馬鞭草總黃酮含量先增加后減少,在液料比40:1時(shí)總黃酮含量最高。這主要是由于前期溶劑量的增多,增大了溶劑與溶質(zhì)的接觸面積,使有效成分浸出完全。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到擴(kuò)散平衡時(shí),黃酮不再浸出,此時(shí)總黃酮含量最高,再增加溶劑的量將不會(huì)提高總黃酮含量,反而浪費(fèi)溶劑,為之后的蒸發(fā)濃縮帶來(lái)困難。因此,液料比為40:1時(shí)最佳。

    圖2 液料比對(duì)馬鞭草總黃酮含量的影響

    3.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響見(jiàn)圖3。

    圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬鞭草總黃酮含量的影響

    由圖3可見(jiàn),在超聲時(shí)間30 min,液料比30:1的條件下,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,馬鞭草總黃酮含量先增加后減少,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %時(shí)總黃酮含量最高。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí),會(huì)使脂溶性雜質(zhì)如色素等的溶出量增加,降低總黃酮的含量,并且不易進(jìn)行后期的分離純化。因此,乙醇體積分?jǐn)?shù)為40:1時(shí)最佳。

    綜上,選取單因素的提取條件為:超聲時(shí)間40 min,液料比40:1,乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %。

    3.2 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)結(jié)果

    以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),根據(jù)表1的設(shè)計(jì)因素水平與編碼,采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)原理對(duì)馬鞭草總黃酮的超聲波提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化,以超聲時(shí)間(X1)、液料比(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)為影響因素,馬鞭草總黃酮含量(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn),設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

    將所得數(shù)據(jù)通過(guò)Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合,得到的二元多項(xiàng)回歸方程為:

    回歸方程分析見(jiàn)表3。

    表3 回歸方程方差分析

    由表3可見(jiàn),模型組的F值為207.91,模型差異極顯著(P<0.01)。一次項(xiàng)X1、X2、X3對(duì)模型的影響均極為顯著(P<0.01),R2=0.9963,數(shù)據(jù)表明所選取的模型相關(guān)度較好,可行性強(qiáng)。由F值可得各個(gè)因素對(duì)馬鞭草總黃酮含量影響的大小順序:乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)>液料比(X2)>超聲時(shí)間(X1)。

    通過(guò)Design-Expert 8.0軟件對(duì)超聲時(shí)間(X1)、液料比(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)各因子間的交互作用進(jìn)行分析,得到了圖4~圖6的響應(yīng)面和等高線圖。響應(yīng)面圖中,響應(yīng)面越陡峭,則該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著;相反則該因素影響不顯著。在等高線圖中,可直接觀察到各影響因子交互作用程度,等高線接近于圓形,影響因子交互作用不強(qiáng);相反,等高線接近于橢圓形,說(shuō)明兩個(gè)影響因子間的交互作用較強(qiáng)[10]。由圖4、圖6可見(jiàn)超聲時(shí)間(X1)與液料比(X2)、液料比(X1)與乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)的等高線接近于橢圓,說(shuō)明超聲時(shí)間(X1)與液料比(X2)及液料比(X1)與乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)有較強(qiáng)的交互作用。由圖5可見(jiàn)超聲時(shí)間(X1)與乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)的等高線接近于圓形,說(shuō)明超聲時(shí)間(X1)與乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)交互作用較小。

    圖4 提取時(shí)間和液料比對(duì)總黃酮含量的響應(yīng)面和等高線分析圖

    圖5 提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮含量的響應(yīng)面和等高線分析圖

    圖6 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮含量的響應(yīng)面和等高線分析圖

    3.3 最佳提取工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

    響應(yīng)面法得到的最佳提取工藝為:超聲時(shí)間40 min,液料比50:1,乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %,提取物中馬鞭草總黃酮含量的預(yù)測(cè)值為3.31 %。對(duì)最佳提取工藝為進(jìn)行驗(yàn)證,得到馬鞭草總黃酮含量的平均實(shí)測(cè)值為3.26 %(n=3),實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的誤差為1.51 %[11],說(shuō)明響應(yīng)面法得到的最佳提取工藝有較強(qiáng)的可行性。

    3.4 馬鞭草總黃酮清除DPPH的能力

    以馬鞭草總黃酮和抗壞血酸的質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo),DPPH的清除率(%)為縱坐標(biāo)繪制曲線,見(jiàn)圖7。由圖7可見(jiàn),5~20 μg/ml濃度范圍內(nèi),馬鞭草總黃酮的清除率小于抗壞血酸(P<0.05),但隨著濃度的增加,40~80 μg/ml濃度范圍內(nèi)馬鞭草總黃酮的清除率大于抗壞血酸(P<0.05)。

    圖7 馬鞭草總黃酮清除DPPH自由基的能力

    3.5 馬鞭草總黃酮清除H2O2的能力

    以馬鞭草總黃酮和抗壞血酸的質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo),H2O2的清除率(%)為縱坐標(biāo)繪制曲線,見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn),馬鞭草總黃酮和抗壞血酸清除H2O2能力均與質(zhì)量濃度成正比,馬鞭草總黃酮對(duì)H2O2的清除作用大于抗壞血酸(P<0.05)。

    圖8 馬鞭草總黃酮清除H2O2的能力

    4 討論

    4.1 馬鞭草具有多種活性成分,其中黃酮類(lèi)化合物的研究逐漸被大家所重視。本項(xiàng)目組采用超聲法提取馬鞭草總黃酮,提取效率高,成分破壞少,并用響應(yīng)面法優(yōu)化馬鞭草總黃酮的提取工藝,得到最佳提取條件為超聲時(shí)間40 min,液料比50:1,乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %。根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)得到的實(shí)測(cè)值為3.26 %,與預(yù)測(cè)值3.31 %的誤差為1.51 %,說(shuō)明該提取工藝有較強(qiáng)的可行性。

    4.2 通過(guò)測(cè)定馬鞭草總黃酮清除DPPH自由基和H2O2的能力,表明其具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。

    4.3 通過(guò)上述研究,確定了馬鞭草總黃酮的最佳提取工藝,為其全面開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù);同時(shí),馬鞭草總黃酮具有較好的抗氧化能力,可作為保健品及化妝品的原料,有較好的開(kāi)發(fā)前景。

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