CrisprCas9系統(tǒng)敲除SDC1表達(dá)對(duì)骨髓瘤U266細(xì)胞增殖的影響

劉琳琳，莊銀蘋(píng)，王 永，徐 凱*

（徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，江蘇 徐州 221004）

基金項(xiàng)目：徐州市科技項(xiàng)目（KC16SY149，KC16SY154）

通訊作者：徐凱，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：xkpaper@163.com

多發(fā)性骨髓瘤是一種極其惡性的血液系統(tǒng)疾病，顯著特點(diǎn)是漿細(xì)胞的克隆性增殖[1]。近年來(lái)，很多新的治療因子被批準(zhǔn)用于治療難治復(fù)發(fā)性骨髓瘤患者，如硼替佐米，來(lái)那度胺，沙利度胺等[2-3]。然而，由于其嚴(yán)重的化療耐受作用，多發(fā)性骨髓瘤仍然是難以治愈的。因此，闡明骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制，尋求新的靶向治療藥物是當(dāng)前骨髓瘤研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。蛋白多糖Syndecan 1（SDC1）是骨髓瘤發(fā)生的重要標(biāo)志分子之一，位于細(xì)胞表面，又稱之為CD138。目前，多種研究證實(shí)SDC1與結(jié)直腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。本研究擬利用CrisprCas9慢病毒系統(tǒng)沉默SDC1基因的表達(dá)，探索其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖的影響，為尋找骨髓瘤治療新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1640培養(yǎng)基（Sigma公司），胎牛血清（Gibco公司），Trizol（Takara公司），SDC1,β-actin一抗和二抗購(gòu)買于Proteintech公司，CD138流式抗體購(gòu)買于BD公司，RPMI-8226,U266和IM9細(xì)胞購(gòu)買于美國(guó)菌種保存中心。

1.2 方法

1.2.1 蛋白免疫印跡（western blot）

用RIPA強(qiáng)裂解液提取目的細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量（凱基生物）。每次取10 μl總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳（80 V 40 min，120 V 60 min），并將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜（100 V 120 min）。5%脫脂奶粉封閉1 h。按照1:1000比例稀釋SDC1，1:5000稀釋?duì)?actin，4℃孵育過(guò)夜，按照1:2000稀釋兔二抗和鼠二抗，室溫孵育1 h，隨后用ECL顯色底物顯影。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）

TRIzol法提取U266細(xì)胞總RNA，取1.5 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：25℃，10 min；37℃，90 min；85℃，5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存。定量PCR引物序列如下：SDC1正向引物：CGTGGGGCTCATCTTTGCT，反向引物：TGGCTTGTTTCGGCTCCTC。β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)體系：SYBR GreenⅠmix10 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物（2μM）各3 μl，RNase- free水補(bǔ)足至20 μl。反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)

正常收取細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)樣品細(xì)胞數(shù)在1×106個(gè)。用100微升FACS buffer重懸樣品細(xì)胞，冰浴10 min，加CD138-BV421抗體2微升，輕輕婚姻，冰上孵育30 min，期間避光放置。然后加上1 ml FACS buffer 1500rpm離心5 min，洗滌2次，隨后用500微升FACS buffer重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 CCK8法測(cè)細(xì)胞活力

將對(duì)照細(xì)胞和沉默SDC1基因表達(dá)的目的細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，每孔接種100 μl細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，經(jīng)不同時(shí)間點(diǎn)處理（24 h，36 h，48 h，72 h），加入CCK8 5μl避光處理3 h，隨后利用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)的吸光度值，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算活力變化情況。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SDC1在多種骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況

我們利用Q-PCR技術(shù)分析了SDC1基因在RPMI-8226,U266和IM9細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果分析SDC1在RPMI-8226表達(dá)較低，在U266和IM9細(xì)胞中表達(dá)較高（圖1）。隨后，我們用U266細(xì)胞沉默SDC1基因，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 SDC1基因在骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 SDC1在U266細(xì)胞中沉默效率的驗(yàn)證

我們利用CrisprCas9慢病毒干擾系統(tǒng)沉默SDC1基因的表達(dá)，通過(guò)Q-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)SDC1敲除效率在70%以上（圖2A）。進(jìn)一步蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CrisprCas9慢病毒干擾系統(tǒng)有效沉默SDC1蛋白的表達(dá)（圖2B）。

圖2 SDC1基因沉默效率的驗(yàn)證**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析CD138標(biāo)志分子的變化情況

沉默SDC1基因表達(dá)以后，我們進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了U266穩(wěn)定沉默SDC1細(xì)胞株的SDC1陽(yáng)性細(xì)胞率，結(jié)果顯示沉默SDC1后CD138陽(yáng)性細(xì)胞顯著降低（圖3），為后續(xù)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

圖3 流式分析CD138陽(yáng)性細(xì)胞分子*P＜0.05

2.4 沉默SDC1后對(duì)細(xì)胞增殖的影響

我們利用已建立穩(wěn)定沉默SDC1基因的U266細(xì)胞系,通過(guò)CCK8法檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)U266 control組及ko SDC1組的細(xì)胞活力情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默SDC1后明顯抑制U266細(xì)胞的活力（圖4）。

圖4 CCK8檢測(cè)沉默SDC1后對(duì)細(xì)胞活力的影響

3 討 論

Syndecan (SDC)是一類進(jìn)化上保守的I型跨膜糖蛋白，可以結(jié)合多種配合和受體，如FGFs，VEGFs，TGF-β，PDGFs，integrin以及VEGFR等。而SDC1是目前研究最廣泛的成員之一，其在腫瘤細(xì)胞中的差異表達(dá)與腫瘤發(fā)生和臨床預(yù)后密切相關(guān)[6-7]。Xu等人發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中SDC1的表達(dá)與惡性進(jìn)程和不良預(yù)后呈正相關(guān)，暗示SDC1在膠質(zhì)瘤發(fā)生過(guò)程中可能扮演重要角色[8]。最近有研究報(bào)道稱，在結(jié)腸炎誘導(dǎo)的結(jié)腸癌的小鼠模型中，干擾SDC1可誘導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)SDC1可能會(huì)調(diào)控粒層細(xì)胞的分化以及卵泡發(fā)育[9]。而SDC1在骨髓瘤進(jìn)程中扮演什么角色呢。

SDC1（CD138）在惡性漿細(xì)胞中高水平表達(dá)，在疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[10-12]。抑制SDC1表達(dá)促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡[13]。CD138是惡性漿細(xì)胞的重要標(biāo)志分子，常用于骨髓瘤細(xì)胞的分離純化。最近有研究分析了正常氧和低氧脅迫條件下CD138分子的表達(dá)變化，分析低氧脅迫可以降低CD138的表達(dá)，與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[14]。本研究首先利用Q-PCR檢測(cè)了多種骨髓瘤細(xì)胞中SDC1基因的表達(dá)情況，采用CrisprCas9慢病毒敲除技術(shù)[15]。建立穩(wěn)定敲除SDC1表達(dá)的U266骨髓瘤細(xì)胞系。利用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，Q-PCR及流式細(xì)胞術(shù)等手段檢測(cè)SDC1敲除效率。通過(guò)CCK8法分析分析敲除SDC1表達(dá)抑制骨髓瘤細(xì)胞的活力。

由于SDC1調(diào)控的靶基因較多，而SDC1也是骨髓瘤患者臨床檢測(cè)的重要標(biāo)志分子之一，對(duì)其參與骨髓瘤進(jìn)程的具體機(jī)制并不十分明確，SDC1基因是如何影響骨髓瘤細(xì)胞的增殖，還需要更加深入的研究。本研究建立的CrisprCas9技術(shù)沉默SDC1的載體可以有效的沉默靶基因的表達(dá)，為進(jìn)一步探究SDC1基因的功能奠定基礎(chǔ)，SDC1有望成為臨床治療難治復(fù)發(fā)性骨髓瘤患者的重要潛在靶點(diǎn)。