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    口服濕熱痹膠囊大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物分析

    2018-09-10 01:01:04潘韜文王嘉一
    關(guān)鍵詞:甲酸乙腈尿液

    李 鑫,楊 鉆,潘韜文,王嘉一,丁 雪,李 坤*

    (1.遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,遼寧 大連 116029;2.大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,遼寧 大連 116044)

    濕熱痹膠囊是中國(guó)傳統(tǒng)中藥復(fù)方,由蒼術(shù)、忍冬藤、地龍、連翹、關(guān)黃柏、薏苡仁、防風(fēng)、威靈仙、防己、川牛膝、粉萆薢、桑枝12味藥材組成,長(zhǎng)期以來(lái)一直用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療。這些草藥都具有強(qiáng)大的抗炎活性[1-12],并且在中國(guó)已經(jīng)有很好的治療風(fēng)濕病和關(guān)節(jié)炎歷史[13]。中藥復(fù)方是通過(guò)眾多的化學(xué)成分相互協(xié)調(diào)作用以發(fā)揮藥效,確定其中化學(xué)成分展開全面研究是十分必要的。因此通過(guò)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)確定濕熱痹膠囊中主要化學(xué)成分以及濕熱痹膠囊在動(dòng)物體藥物原形成分,為尋找其中的活性化學(xué)物質(zhì)提供基礎(chǔ),同時(shí)為濕熱痹膠囊在中醫(yī)臨床實(shí)踐中治療類風(fēng)濕關(guān)性節(jié)炎奠定科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

    SPF級(jí)SD大鼠,雄性,體重(200±20)g,由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)所使用動(dòng)物嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)指導(dǎo)原則進(jìn)行,所使用動(dòng)物征得大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意。

    濕熱痹膠囊提取膏(本溪國(guó)藥中成藥工程技術(shù)研究中心有限公司),羧甲基纖維素鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠),肝素鈉(大連美倫生物技術(shù)有限公司),色譜純甲醇(瑞典Oceanpak公司),色譜純乙腈(瑞典Oceanpak公司),超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司),Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司),Agilent 6530 四極桿飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫科技有限公司),UGC-12W氮吹儀(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司),大鼠代謝籠(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)

    1.2 給藥設(shè)計(jì)

    濕熱痹膠囊提取膏成人推薦用法用量:口服,一次4粒,一日3次。根據(jù)人和動(dòng)物間按體表面積折算,換算為大鼠劑量:等劑量比值×(藥量/人的體重),其中成人標(biāo)準(zhǔn)體重設(shè)置為70 kg。

    根據(jù)推薦劑量,設(shè)定本試驗(yàn)的臨床劑量為正常給藥的劑量,換算為大鼠給藥劑量:濕熱痹膠囊提取膏,臨床劑量0.71 g/kg。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1生物樣品的收集

    將SD大鼠隨機(jī)分為兩組(n=3),即空白組和給藥組??瞻捉M給予等劑量的生理鹽水,給藥組按0.71 g/kg劑量給大鼠灌胃,所有大鼠分別安置在代謝籠中用于收集尿液和糞便。在給藥后12 h,收集每只大鼠的尿液和糞便。尿液和糞便樣品保存在-80 ℃。所有大鼠再次分別灌胃給予生理鹽水和濕熱痹膠囊,并于在給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h眼眶靜脈叢取血(約800 μL)于預(yù)先涂有1%肝素鈉生理鹽水的Eppendorf 管中,立即將血液樣品以4000 r/min(4 ℃)離心10 min以獲得血漿樣品。血漿樣品保存在-80 ℃。

    1.3.2濕熱痹膠囊供試品溶液制備

    取濕熱痹膠囊樣品,研細(xì),取0.5 g,精密稱定,于50 mL的定容瓶中,加入50 mL色譜純甲醇,密塞,然后將混合物在超聲處理(250 W,頻率100 kHz)30 min,然后以13 000 r/min下離心10 min,取上清液,將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

    1.3.3生物樣品供試品溶液制備

    血漿樣品供試液的制備:冷凍血漿樣品在室溫解凍,渦旋30 s,然后將200 μL血漿和600 μL乙腈混合。將這些混合液渦旋3 min,靜置5 min,然后以13 000 r/min離心10 min以沉淀蛋白質(zhì)。取上清液600 μL于1.5 mL Eppendorf管,混合各時(shí)間點(diǎn)的上清液,最終用氮?dú)獯蹈伞?80 ℃凍存直至分析。復(fù)溶:50 μL甲醇重構(gòu)并超聲處理,然后以13 000 r/min離心10 min,將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

    尿液樣品供試液的制備:冷凍尿液樣品在室溫解凍,渦旋30 s,然后將500 μL尿液和500 μL乙腈混合。將這些混合液渦旋3 min,靜置5 min,然后以13 000 r/min離心10 min以沉淀蛋白質(zhì)。取上清液800 μL于1.5 mL Eppendorf管,用氮?dú)獯蹈伞?80 ℃凍存直至分析。復(fù)溶:100 μL甲醇重構(gòu)并超聲處理,然后以13 000 r/min離心10 min,將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

    糞便樣品供試液的制備:冷凍的糞便樣品在37 ℃干燥,然后粉碎并充分混合。將2 mL甲醇加入0.1 g糞便粉末中。在超聲波浴將糞便樣品提取30 min,然后13 000 r/min離心10 min,取上清液1200 μL于1.5 mL Eppendorf管,用氮?dú)獯蹈伞?80 ℃凍存直至分析。復(fù)溶:200 μL甲醇復(fù)溶并超聲處理,然后以13 000 r/min離心10 min,將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

    1.4 樣品檢測(cè)

    1.4.1色譜條件

    色譜柱為Waters公司C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),柱溫40 ℃。流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液,流速0.4 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL,注射泵方式連續(xù)進(jìn)樣。分析條件:采用梯度洗脫,0 min時(shí)0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(95∶5,V/V),在4 min內(nèi)升到0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(80∶20,V/V),并維持等度洗脫至8 min,于14 min時(shí)升到0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(10∶90,V/V),并維持等度洗脫至17 min。

    1.4.2質(zhì)譜條件

    采用電噴霧電離離子源,正、負(fù)離子模式檢測(cè):干燥氣體(N2)流速10.0 L/min;干燥氣體溫度350 ℃;鞘氣流量12.0 L/min;鞘氣溫度400 ℃;噴霧器氣體壓力30 psig(1 psi=6894.76 Pa);毛細(xì)管電壓4 kV;碎片電壓120 V;錐孔電壓65 V;光學(xué)相干斷層掃描射頻750 V;MS/MS實(shí)驗(yàn)碰撞電壓10/30 eV;一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍m/z 100~1500,二級(jí)離子掃描范圍m/z 100~1500。

    2 結(jié) 果

    2.1 血漿中藥物成分

    血漿成分分析存在著含量低、組分多、分離難、生物個(gè)體差異大的特點(diǎn),質(zhì)譜法測(cè)定入血成分快速、微量、精確。通過(guò)UPLC-MS法對(duì)濕熱痹膠囊組的大鼠血漿樣品進(jìn)行分析,并與空白組比較,發(fā)現(xiàn)濕熱痹膠囊中有7個(gè)化學(xué)成分能被吸收進(jìn)入血液(見(jiàn)表1,圖1)。本實(shí)驗(yàn)血漿樣品中,檢測(cè)到7種原型入血成分,可能為濕熱痹膠囊的藥效物質(zhì)。但由于血漿中化合物濃度較低,混合時(shí)間點(diǎn)取樣以及對(duì)代謝產(chǎn)物的研究有限,未確定是否有新的代謝產(chǎn)物出現(xiàn)。

    2.2 尿樣中藥物成分

    SD大鼠灌胃給予濕熱痹膠囊后其尿液樣品進(jìn)行檢測(cè),并比較給藥血樣、空白血樣、濕熱痹膠囊的提取液基峰離子圖,共檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6個(gè)藥物成分(原型成分),其成分見(jiàn)表2,圖2。

    2.3 糞便中藥物成分

    SD大鼠灌胃給予濕熱痹膠囊后其糞便樣品進(jìn)行檢測(cè),并比較給藥血樣、空白血樣、濕熱痹膠囊的提取液基峰離子圖中,共檢測(cè)發(fā)現(xiàn)11個(gè)藥物成分(原型成分),其成分見(jiàn)表3,圖3。

    3 討 論

    采用UPLC-MS法在濕熱痹膠囊分析出114種成分。分析出濕熱痹膠囊中7種入血的原型成分;在尿液中分析出濕熱痹膠囊原型成分6種;糞便中分析出濕熱痹膠囊原型成分11種。推測(cè)其可能為濕熱痹膠囊發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制,應(yīng)進(jìn)一步對(duì)24種原型成分進(jìn)行抗炎、抗病毒等體外活性測(cè)試,期望篩選出具有抗炎、抗病毒的活性單體。

    濕熱痹膠囊是傳統(tǒng)復(fù)方中藥,在臨床中應(yīng)用較為廣泛,祛風(fēng)除濕、清熱消腫、通絡(luò)定痛。用于濕熱痹證,其癥狀為肌肉或關(guān)節(jié)紅腫熱痛,有沉重感,步履艱難,發(fā)熱,口渴不欲飲,小便黃淡。研究結(jié)果表明,UPLC-MS法可以快速、系統(tǒng)地對(duì)濕熱痹膠囊中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。研究較為全面系統(tǒng)地闡明濕熱痹膠囊的化學(xué)成分組成、探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為濕熱痹膠囊的質(zhì)量控制研究及臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。通過(guò)UPLC-MS法分析生物樣品(血漿、尿液及糞便)中濕熱痹膠囊中原型成分,為尋找其中的活性化學(xué)成分提供物質(zhì)基礎(chǔ),同時(shí)為濕熱痹膠囊在中醫(yī)臨床實(shí)踐中治療類風(fēng)濕關(guān)性節(jié)炎提供科學(xué)依據(jù)。

    表1血漿樣品中藥物成分

    NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions10.96C4H6O4Succinic acid117.0189[M-H]-(4.02)100.928623.55C17H24O9Syringa vulgaris395.1315[M+Na]+(-0.62)107.9641;184.8831;283.7984;382.268734.39C16H22O9Sweroside403.1271[M+COOH]-(-0.75)154.8969;228.8376;290.6950;332.762745.97C16H18O6Cimifugin307.1176[M+H]+(0.12)118.6173;141.9530;227.0545;298.141456.59C14H12O4Tetrahydroxystilbe-ne(isomer)289.0729[M+COOH]-(-4.7)123.1822;154.9076;186.9998;251.001168.86C19H22O5Imperanene331.1533[M+H]+(-2.03)164.9180;204.8883;252.8219;314.1860713.05C18H30O2α-linolenic acid301.2147[M+Na]+(-4.22)273.1498;225.1413;173.0975;159.1117

    表2尿液樣品中藥物成分

    NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions12.38C16H24O10Loganic acid399.1261[M+Na]+(0.32)179.0289;203.0538;219.0624;237.070124.36C17H26O10Loganin435.1516[M+COOH]-(-2.04)274.8388;238.9982;217.997535.27C22H24O93-Methoxynobile-tin477.1402[M+COOH]-(0.23)164.9221;268.7968;350.8278;410.736545.44C23H26O11Calceolarioside A477.1383[M-H]-(3.81)154.9031;215.9946;311.0420;393.343655.72C37H40N2O6Fangchinoline609.2963[M+H]+(-0.48)192.1000;367.1628;546.2193;578.2543610.09C27H34O11Arctiin(isomer)552.2437[M+NH4]+(0.39)201.0811;277.1273;384.6462;480.3543579.2075[M+COOH]-(1.49)268.8031;394.7677;464.0126;545.8841

    表3糞便樣品中藥物成分

    NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions12.341C13H10O2Atractylodinol216.1[M+NH4]+(4.53)136.9224;177.9454;199.943822.408C6H6O35-Hydroxymethylfurfural127.0388[M+H]+(1.32)112.086832.601C16H18O9Chlorogenic acid353.0833[M-H]-(-1.27)179.0366;135.042242.988C26H32O12Phellodendroside554.2209[M+NH4]+(4.21)138.9018;246.7883;342.8087;474.200353.834C20H18O5Moracin H356.1494[M+NH4]+(-0.45)177.0799;192.1017;251.0683;285.107564.033C20H23NO4Isocorydine342.1698[M+H]+(0.59)137.0608;177.0783;192.0989;214.081775.409C21H25NO4Tetrahydropalmatine356.1857[M+H]+(-0.31)170.7499;220.0862;264.0776;291.624286.619C38H42N2O6Menisine(isomer)623.3121[M+H]+(-0.92)174.0901;381.1806;592.266796.636C38H42N2O7Fenfangjine A639.306[M+H]+(0.76)192.0987;318.1532;452.7926;567.29421010.117C19H21NO2Argentinine296.1645[M+H]+(0.18)136.0610;166.0666;194.8710;254.53811111.361C39H62O12Ophiopogonin C'723.4305[M+H]+(1.85)685.4343;556.2338;432.6841;373.1499

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